分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2018-05-23 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 裂壶藻作为一种生产DHA的重要菌种，其脂肪酸合成途径除了已经被广泛了解的聚酮合酶（PKS）途径外，还残存着作为真核微生物中常见的脂肪酸合酶（FAS）途径中的功能酶和中间产物。经过前期的研究，运用基因工程手段，将载有与裂壶藻近缘藻种中已知的Δ12-desaturase表达模块和相关筛选标记构建入载体，通过电击转化导入Schizochytrium sp.ATCC20888中， 以期望修复裂壶藻中FAS途径合成的合成能力由气相色谱分析转化。通过分子水平检测确定目的功能基因已稳定转化后，再株油脂中相关脂肪酸含量分布情况。经过长期筛选验证，最终证明获得了两株阳性转化株,其生物量初步测定分别较野生株提高11.14%和4.12%，其油脂中DHA含量分别较野生株提高了19.50%及14.65%。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2018-05-23 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 随着全球变暖和能源危机日益加剧，生物丁醇因能用作清洁能源和重要化学品而备受关注。大肠杆菌（Escherichia coli）由于具有优良的遗传操作性能成为丁醇生产的底盘菌，但丁醇对细胞的毒害作用已成为提高工程菌丁醇产量的瓶颈，因而增强E. coli丁醇耐受性是提高工程菌丁醇产量的必要前提。为此，需要详细了解E. coli丁醇耐受机制。丁醇可破坏细胞膜的屏障作用、扰乱物质转运和传递功能，细胞产生与热激、渗透等胁迫类似的生理应答反应，通过转录与翻译调节应答丁醇胁迫。从上述几个方面综述了E. coli丁醇耐受机制,并总结了运用基因工程理性设计获得丁醇耐受菌株的研究进展。然而目前丁醇耐受机制尚未完全揭示，限制了理性设计策略的应用，因此文中也概括了运用定向进化获得耐受丁醇菌株并解析丁醇耐受功能基因的反向代谢工程策略在此方面的研究进展。同时也关注和评述了最新的组合策略、化学修饰方法提高E. coli丁醇耐受性的研究。最后总结和展望了提高底盘菌株E. coli丁醇耐受性的关键策略。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2018-05-23 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 甜菜素是一种植物源的水溶性天然含氮色素，用于食品添加剂和化妆品等行业中。在植物中甜菜素和花青素色素互不共存，其代谢途径是重要的植物化学分类指标。甜菜素兼具抗氧化、抗肿瘤、抗疟、保肝等药理作用，其潜在的医疗保健价值以及其代谢途径的独特性，促进了对甜菜素深入研究。综述了甜菜素合成途径中的关键酶和合成生物学策略生产甜菜素的国内外研究进展，为建立合成生物方法生产甜菜素提供参考。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2018-05-23 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 目的：为真核表达猪白细胞介素17(IL-17)，研究产物在细胞培养下的免疫生物活性。方法：通过PCR扩增出猪IL-17基因并插入到真核表达载体pVAV1，然后转染到IPEC-J2细胞、HaCaT细胞和L02细胞中。在转染后第24、48和72h收集细胞，第48h收集上清液。收集细胞通过实时荧光定量PCR检测相关免疫基因的表达水平，收集上清液通过抑菌试验检测相关抗菌肽的生物活性。结果：采用pVAX1载体构建了表达猪IL-17的重组质粒，转染到细胞中。证实IL-17基因能诱导抗菌肽基因（RegⅢ、S100A8和BD2）的表达，显著上调JAK-STAT信号通路基因（JAK1、STAT1和STAT3）和细胞因子基因（IL-6、IL-12和TNF-α）的表达。此外，细胞上清液能够在不同程度上抑制大肠杆菌及金黄色葡萄球菌的增殖。结论：成功将猪IL-17基因真核表达，其表达产物能诱导效应细胞表达多种细胞因子，产生多种抗菌肽，具有抑菌能力；这为进一步研发猪IL-17作为抗菌免疫分子制剂奠定了初步基础。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2018-05-23 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 目的 运用Cre/Loxp重组酶系统构建肝脏特异性CD36基因敲除小鼠并进行鉴定和验证，为研究CD36的生物学功能奠定基础。 方法 构建CD36打靶载体，电转转染胚胎干细胞，通过长链PCR筛选出正确同源重组的阳性克隆，阳性胚胎干细胞克隆经扩增后，注射入C57BL/6J小鼠的囊胚中，获得嵌合小鼠，再与Flp小鼠交配筛选获得Flox杂合子小鼠，该小鼠与引进的Alb-Cre小鼠交配，在F3代获得CD36fl/fl:Alb-Cre+基因型小鼠，即为肝脏特异性CD36敲除小鼠。采用PCR鉴定小鼠基因型，PCR、实时荧光定量PCR和Western blot验证小鼠肝脏CD36敲除效果，Western blot检测小鼠肾脏、脂肪和心肌组织CD36表达情况，HE染色观察小鼠肝脏形态学改变。 结果 建立了CD36基因的Flox杂合子小鼠，与Alb-Cre小鼠交配后，在F3代筛选出CD36fl/fl:Alb-Cre-和CD36fl/fl:Alb-Cre+基因型小鼠，DNA水平证实CD36fl/fl:Alb-Cre+基因型小鼠肝脏CD36基因通过Cre/Loxp重组酶系统被敲除。与CD36fl/fl:Alb-Cre-基因型小鼠相比，CD36fl/fl:Alb-Cre+基因型小鼠肝脏CD36mRNA和蛋白表达水平显著降低，肾脏、脂肪和心肌组织CD36蛋白表达无差别，肝脏形态学特征无明显差异。结论 通过Cre/Loxp重组酶系统成功构建了肝脏特异性CD36基因敲除小鼠，为研究CD36在肝脏代谢和肝脏疾病中的功能提供了动物模型
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2018-05-23 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 昆虫细胞-杆状病毒载体表达系统（Baculovirus expression vector system，BEVS）是病毒样颗粒亚单位疫苗（Virus like particles, VLPs）的理想生产平台。动物细胞培养过程分析技术（Process analytical technology, PAT）研究的重点在于更多地获取与细胞生理状态相关的过程参数，以及实现过程敏感参数的在线表征和过程控制关键时间节点的在线判定，从而指导过程优化和控制。本研究通过昆虫Sf9细胞的分批和补料悬浮培养，发现细胞代谢活性与在线特征频率（fc）之间存在相关性。以fc作为细胞代谢活性的在线指征，在细胞代谢活性下降之前补料，使得Sf9细胞在代谢活性明显增强的基础上，最高活细胞密度提高1.75倍。通过分批培养与补料分批培养过程细胞生理特性参数的相关性分析，发现比电容增长速率（με）与培养体系S-期细胞比例之间存在相关性，με作为细胞增殖活性状态的在线指征参数，可以作为最佳接毒时间的判定依据。此外，研究还发现在线检测参数电容（ε）与最高疫苗产量之间存在相关性，可以作为疫苗最佳收获时间的在线表征参数。以在线fc值作为补料时间指征，以在线με值作为病毒感染时间指征，以在线ε值作为病毒收获时间指征，实现了猪圆环病毒2型（PCV2）VLPs的高效生产。相比于批培养，基于PAT的生产工艺疫苗单位体积产量提高76%，生产周期缩短了24 h。本研究为PCV2病毒样颗粒亚单位疫苗大规模生产提供了一种新的高效生产模式。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2018-05-23 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 以ε-聚赖氨酸产量为1.60 g/L的Streptomyces albulus M-Z18为出发菌株，利用核糖体工程技术选育具有双重抗生素抗性的ε-聚赖氨酸高产菌株，并对高产菌株和出发菌株的生理生化性能进行比较。通过链霉素诱变成功选育出了1株遗传稳定的ε-聚赖氨酸产生菌S. albulus S-7，ε-聚赖氨酸产量为2.03 g/L；对S. albulus S-7叠加巴龙霉素，获得1株遗传稳定的具有双重抗性的ε-聚赖氨酸产生菌S. albulus SP-14，ε-聚赖氨酸产量为2.37 g/L，比出发菌株S. albulus M-Z18的ε-聚赖氨酸产量增加了48.10%。使用链霉素和巴龙霉素选育具有双重抗生素抗性的ε-聚赖氨酸高产菌株是一种有效的手段。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2018-05-23 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs) 具有很强的自我复制能力和多向分化潜能，是近年来热门研究的种子细胞。MSCs的生长微环境可以影响调控干细胞的生长、分化，力学刺激是MSCs分化的影响因素之一。细胞外基质硬度、机械应力（剪切力、静压力、牵张力）、微重力等因素对MSCs的分化作用是当前研究的热点。本文从细胞外基质硬度、机械应力以及机械应力作用于三维支架培养对MSCs分化的影响等方面进行综述。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2018-05-23 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 在细菌生长过程中,细胞壁起到维持细胞形状和完整性，抵抗内部膨胀压的作用。细胞壁的合成、分裂、再生、循环再利用等与细菌自身生长繁殖和应对环境压力息息相关。目前，细胞壁生长机理，细菌如何调控细胞壁生长及如何与其他细胞过程相协调的机制尚未研究清楚。细胞壁调控机制的解析对了解细菌细胞壁功能、确定药物的作用方式和发展新一代的治疗方法至关重要。本文对细菌调控细胞壁生长机制的国外研究进展进行了概述，重点阐述了支架蛋白、转录因子、非编码小RNA及蛋白相互作用调控细胞壁的合成、细胞分裂、压力响应的机制，总结了细胞壁调控机制在抗菌药物研发中的应用，并对未来的研究方向进行了展望。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2018-05-23 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 专利是技术的有效载体，通过专利态势分析可以在一定程度上有效掌握技术发展脉络及发展趋势。基于专利信息，采用定量数据、定性调研与专家智慧有机结合的方法，从申请趋势、保护市场、领域分布、重要专利权人等多维度分析视角进行农业生物技术领域专利技术态势分析。通过专利态势分析掌握全球农业生物技术专利保护概貌，指出重点方向。在此基础上结合中国农业生物技术领域专利法律状态和专利转让许可状况探讨中国农业生物技术专利保护现状及存在问题，以期支撑中国农业生物技术领域的创新决策。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2018-05-23 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： R-2-卤代酸脱卤酶能立体选择性水解R-2-卤代酸。解析酶的单晶结构对提高酶的选择性和活性提供了直接的结构指导，是目前酶结构领域研究的前沿。以实验室前期得到的来自假单胞菌ZJU26的R-2-氯丙酸脱卤酶（DehDIV-R）为研究对象，采用X射线衍射晶体法进行结构解析。采用ppSUMO载体融合表达DehDIV-R蛋白，依次通过Ni-NTA亲和层析、透析酶切、二次Ni-NTA亲和层析以及凝胶过滤层析纯化得到单一条带，且均一性好的蛋白。接着对结晶条件进行初筛与优化，得到的最佳结晶条件为0.1 mol/L HEPES pH 7，12% PEG 6000，0.2 mol/L MgCl2 ，8 mmol/L CHAPS。晶体在上海同步辐射光源BL18U1线站上收集衍射数据，采用分子置换法成功解析获得了分辨率为2.35 Å的DehDIV-R的晶体结构。Ramachandran图表明98.02%的氨基酸位于最适区，证明了该结构的合理性。DehDIV-R的纯化、结晶以及结构解析为进一步深入了解其结构和功能奠定了基础。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2018-05-23 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 目的：筛选高表达单克隆细胞株，并通过优化培养基及流加物，最终达到提高目的蛋白产量及质量的目的。方法：通过有限稀释法对转染目的蛋白的CHO-S细胞进行单克隆化，应用双抗夹心ELISA方法对单克隆细胞株抗体表达量进行初步评估，最后根据筛选细胞株的活率、密度、产量及代谢情况，选择2-3株单克隆细胞进行培养条件优化，并对获得的发酵液进行纯化捕获，根据抗体蛋白表达量、糖型、等电点、纯度、酸碱峰分布等进行相应的评估分析，筛选出最优细胞株及最优培养方案。结果：经过单克隆化处理以及培养条件优化，蛋白的表达量由初始的不到500mg/L提升到2290mg/L ，且抗体蛋白纯度高达97.48%。抗体蛋白质量分析结果显示B1方案为本次实验最优培养方案。结论：通过细胞株筛选、培养基优化能显著提高抗体蛋白的产量及质量，同时对抗体蛋白糖型、等电点、纯度等均有一定程度的优化。因此工业生产中我们完全可以通过高表达克隆的筛选、培养工艺优化等对目的蛋白产量及质量进行一定程度的改善与提高，本次研究对后期实验研究及工业化方案开发都具有很好的指导意义。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2018-05-23 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 开展雨生红球藻基因组测序研究，对于解读绿藻起源与进化及生物逆境胁迫响应机理，及推动雨生红球藻产业发展都具有重要意义。利用Illumina Hiseq 2500对雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)进行高通量测序，获得低覆盖度全基因组草图。通过计算k-mer分布预测该基因组草图大小约为547 Mbp，GC含量为59.2 %，为纯合或单倍体。共得到11,059个预测基因，平均基因长度为1,711 bp，平均CDS长度为681 bp；平均每个基因包含3.2个外显子，外显子平均长度为353 bp。代谢通路分析表明，具有完整的糖酵解、三羧酸循环、磷酸戊糖途径、嘌呤和嘧啶合成等基本代谢通路。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2018-05-16 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 利用hiTAIL-PCR(High efficient thermal asymmetric interlaced PCR)法扩增获得了转基因水稻BPL9K-2的外源基因插入位点的左旁侧序列450 bp，与水稻参考基因组数据比对发现其左边界插入在水稻基因组第10号染色体短臂的1037765位核苷酸残基之后。根据水稻参考基因组序列和外源基因右边界序列，设计引物扩增得到485 bp的特异片段，通过数据库比对发现其右边界插入在水稻基因组第10号染色体短臂的1037825位核苷酸残基之前。因为外源基因插入和非正常重组，水稻基因组上缺失了59个核苷酸。基于左右旁侧序列，建立了转基因水稻BPL9K-2的事件特异性定性PCR检测方法，可以分别扩增到片段大小为449 bp和485 bp的特异条带。该方法特异性好，灵敏度高，能够在BPL9K-2基因组DNA相对含量为0.1%的模板中检测出转基因成份。依据旁侧序列，建立了快速鉴定转基因后代植株外源基因型的三引物PCR检测方法。这些方法的建立，为转基因水稻BPL9K-2的应用和检测提供了技术支持。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2018-05-16 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 生物基产品是指以可再生资源（如农业和林业残渣、有机废料等）为原料而生产的化工产品和绿色能源，因其环境友好的优越性已成为社会经绿色可持续发展的重要途径。近年来，欧美等发达国家纷纷出台战略政策促进生物基产业的发展。欧盟委员会对生物基的研究与创新（R&I）项目给予了政策与财政的重点支持，已经逐渐形成以BBI（Bio-Based Industries）计划为核心的管理与资助体系。本文通过对欧盟生物基R&I项目的资助框架和经费分配情况的调研与分析，发现欧盟实现生物基经济目标的具体措施和实践方案，我国生物基创新行动提出决策建议。同时，BBI计划作为欧盟新兴产业R&I体系建设的典型案例，对我国其他创新方向开展科技政策与管理机制改革也具有一定的参考价值。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2018-05-16 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： β2糖蛋白Ⅰ ( beta 2- glycoprotein Ⅰ，β2GPⅠ ) 是抗磷脂综合征(antiphospholipid syndrome，APS) 血清中抗磷脂抗体(antiphospholipid antibody，aPL)的主要抗原。β2GPⅠ 通过第五结构域与阴性磷脂oxLDL结合，进而被aPL识别，是APS动脉血栓发生的关键事件。本研究构建了编码β2GPⅠ第五结构域（ß2GPⅠ-DⅤ）、ß2GPⅠ-DⅤ突变体及ß2GPⅠ-DⅤ的Phe280-Ala320片段的原核表达载体，对其进行诱导表达和纯化，解析了ß2GPⅠ-DⅤ与阴性磷脂结合的分子机制，结果表明，β2GPI-DV中Cys281-Cys288以及Ser311-Lys317区段在空间上维持一定构型是与CL结合所必须的前体条件，而C245-C296，C288-C326两个二硫键在维持二者空间构型方面起到一定的作用。在此基础上，我们进一步检测了具有结合CL生物学活性的rDV结合oxLDL以及APS血清中oxLDL的活性，表明rDV具有与天然β2GPⅠ相一致的生物学活性。本研究获得的rß2GPⅠ-DⅤ，以及与oxLDL结合的方法体系的建立，为APS早期实验室诊断奠定基础。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2018-05-16 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： (S)-6-氯-3-羰基-5-羟基己酸叔丁酯（(S)-CHOH）是他汀类药物合成的关键手性中间体。利用醇脱氢酶催化6-氯-3,5-二羰基己酸叔丁酯不对称合成(S)-CHOH是很有潜力的制备路线，目前存在的主要问题是醇脱氢酶催化活性较低。首先对来源于Lactobacillus kefir DSM 20587的醇脱氢酶的四点突变体LkTADH（A94T/F147L/A202L/L199H）进行回复突变，确定了关键位点147和202位，并获得比酶活提高1倍的突变体M F147L-A202L。对这两个位点进行饱和突变，获得比酶活比LkTADH提高1.47倍的突变体M F147I-A202L。其比酶活为10.17U/mg，为目前文献报道最高水平。通过动力学分析和分子对接，分析了突变位点对酶活影响的机理，为后续研究奠定了良好的基础。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2018-05-16 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 近年来，哺乳动物细胞培养技术发展迅猛，基于此技术的生物制药行业更是异军突起。在激烈的生物药市场竞争中，缩短研发时间和降低研发成本是制胜的关键。与传统的生物反应器相比，高通量微型生物反应器具有操作简单、运行通量高、实验重复性好等优点，可大大缩短研发周期，降低人力、物力成本，因此成为了生物制药行业最新的研究热点之一。目前，已成功应用于生物药物研发的微型生物反应器有SimcellTM、Ambr 15TM、Ambr 250TM等，分别适用于工艺开发中的不同阶段。本文将以这三种微型生物反应器为例，介绍高通量微型反应器在哺乳动物细胞培养工艺开发中的研究现状及发展前景。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2018-05-16 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 细胞穿膜肽（Cell-penetrating peptide,CPP）作为一种体内大分子药物跨膜运输载体被广泛研究和应用。中期因子Midkine（MK）是人体的一种带有肝素结合域（Heparin-Binding Domain，HBD）的生长因子。本文报道了MK中HBD的部分富含碱性氨基酸的基因序列（命名为MK-S0）与绿色荧光蛋白（EGFP）基因融合表达后，能将EGFP有效地转运入胞内，且其穿膜转运效率高于经典穿膜肽Tat。将MK-S0序列进行进一步突变优化改造得到的MK-∆4，其穿膜效率比天然序列来源的MK-S0提高16倍以上，且MK-∆4的穿膜转运作用适用于多种肿瘤细胞。穿膜机理分析研究结果显示，MK-∆4可与细胞表面硫酸乙酰肝素结合，随之以巨胞饮形式内吞入胞。采用MTT方法检测的细胞生长抑制试验结果显示，连接有MK-∆4的苦瓜来源的核糖体失活蛋白MAP30比单独的MAP30对HeLa肿瘤细胞的IC50值降低5.8倍，大大提高了这种药物蛋白抑杀肿瘤细胞的效果。由此表明，源于MK的这种经过突变改造的MK-∆4，可作为一种新型高效的细胞穿膜肽，将药物蛋白有效运输到细胞内发挥抗肿瘤效应。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2018-05-16 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 目的借助实验室前期质谱分析技术和数据分析研究基础，采用免疫共沉淀(Co-IP)和蛋白沉降实验(GST pull-down)验证HBV X蛋白与Tab1蛋白的相互作用，为进一步研究HBx在HBV慢性感染致癌机制中的作用提供一定的实验依据。方法成功构建pGEX-2TK-GST-HBx质粒，对GST-HBx融合蛋白进行诱导表达，与GST-beads结合孵育，构建pcDNA3.1/myc-His(-)B-Tab1，转染293T细胞使其表达，然后GST pull-down体外试验验证二者的相互作用；构建pcDNA3.1/myc-His(-)B-Tab1和pcDNA3.1-3×flag-HBx真核表达质粒, 共转染293T和HepG2细胞使其表达，通过Co-IP实验验证抗Myc抗体可以将HBx从细胞裂解液中沉淀下来，证实了它们在两种细胞系中存在相互作用。 结果显示了HBx和Tab1在体内外条件下能够发生相互作用，为进一步明确HBV X蛋白功能及作用机制奠定基础。
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