分类: 生物学 >> 植物学 >> 应用植物学 提交时间: 2023-12-24 合作期刊: 《广西植物》
摘要: 为探究CRISPR/Cas9 基因编辑技术构建烟草突变体库的可行性,该研究筛选了100 个可能 参与烟草香气代谢的基因,设计相应的100 个sgRNA 并构建了由100 个CRISPR/Cas9 编辑载体组 成的质粒库,获得转基因材料后分析了载体的共转化率、靶向编辑效率和脱靶编辑情况。结果表明: (1)通过农杆菌介导100 个sgRNA 的共转化后,在172 个阳性转化株中检测到了其中的77 个sgRNA, 共转化效率为77%;(2)在77 个携带sgRNA 的转基因后代中,69 个sgRNA 对目标基因进行了靶 向编辑,编辑效率为89.9%;(3)脱靶位点测序检测发现,只有一个sgRNA 在非目标靶位点产生 了脱靶编辑,表明CRISPR/Cas9 基因编辑技术在烟草中的脱靶概率非常低。综上所述,利用 CRISPR/Cas9 载体库共转化对烟草基因进行高通量靶向编辑以构建突变体库的方法是切实可行,且 该方法有共转化效率高、编辑效率高和脱靶编辑概率低等特点。
分类: 生物学 >> 植物学 >> 应用植物学 提交时间: 2022-07-05 合作期刊: 《广西植物》
摘要: 绣球 (Hydrangea macrophylla) 是以花序为主要观赏部位的园林植物,多用作切花装饰和景观营造,在亚洲、美洲、欧洲广泛栽培。为探究 AP3 基因在绣球花萼形成过程中的功能,加快重瓣绣球新品种培育进程,该研究以绣球‘杜丽’为材料,克隆其 MADS-box B 类基因 HmAP3,并结合生物信息学方法预测基因功能;根据 HmAP3 序列信息,筛选出高特异性编辑靶点并构建 CRISPR/Cas9 基因编辑载体,通过农杆菌转化法将载体整合到绣球基因组中。结果表明:(1) HmAP3 全长 546 bp,共编码 181 个氨基酸,测序结果表明其氨基酸序列与参考序列一致性为 100%,与拟南芥 AtAP3 相似度为 58.8%;(2)不同属植物 AP3氨基酸序列差异较大,在同属不同物种中 AP3 蛋白主要结构则较为保守,仅在少数基序上存在差异;(3)在 HmAP3 中共鉴定到 2 个高特异性靶点,并成功构建 2 个单靶点 CRISPR/Cas9基因编辑载体;(4)本研究共获得 5 株基因组内含有 Cas9 序列的抗性芽,但其靶点均未突变,在抗性芽中没有检测到 Cas9 表达。本研究探讨了 AP3 基因在重瓣绣球育种中的价值,对绣球的 CRISPR/Cas9 基因编辑技术进行了初探,为绣球优良品种繁育工作奠定基础。
分类: 生物学 >> 生物工程 提交时间: 2019-01-17 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要: 通过目的基因的随机整合方式,构建得到的CHO表达细胞系,常会因为目的基因插入到染色体内不稳定区域,而在长期传代过程中出现表达不稳定的现象,这主要是由于位点效应所导致。为了解决这个问题,现利用CRISPR/Cas9技术介导的同源重组,将目的基因直接整合于CHO细胞染色体上稳定表达区域,以克服位点效应带来的CHO表达细胞系的长期表达不稳定。现总共利用该技术获得了2株外源基因(人白蛋白基因)定点整合细胞系;western blot结果显示,细胞上清液的产物具有人白蛋白抗原性;细胞在贴壁状态下,两株细胞系在第3、12、23、35、50代,细胞每日表达的HSA质量接近,且均维持在0.5 pg/cell/day;选取一株表达细胞系,经悬浮驯化后,在批次条件培养下,第1、25及50代的悬浮细胞,在摇瓶内的表达浓度均稳定在13-14 mg/L。本研究显示了将外源基因基因定点整合于CHO细胞基因组内的的可行性;且外源基因整合在稳定表达区域后,重组细胞系具有对外源基因长期表达的稳定性。
分类: 生物学 >> 生物工程 提交时间: 2018-10-09 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要: CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas(CRISPR-associated)系统是近年来发展起来的新型的基因编辑技术,在生物医学领域得到广泛应用。CRISPR/Cas9系统需要在gRNA存在的条件下通过Cas9蛋白实现对基因组的定点编辑,通常情况下以慢病毒感染或质粒转染等方式提供Cas9和gRNA。但是,这些方式容易引起免疫反应及基因片段不可控插入,存在一定的风险,限制了CRISPR/Cas9技术在机体的应用。近年来发展起来的基于体外组装的核糖核蛋白(Ribonucleoprotein, RNP)转导入胞的策略由于快捷安全、编辑的脱靶率低等优势引起广泛关注。本文对Cas9 RNP的转导方式及其应用进行了总结,并就其目前存在的问题进行探讨,以期为CRISPR/Cas9技术的进一步发展提供依据,为拓展其应用奠定基础。
分类: 生物学 >> 生物工程 提交时间: 2018-07-15 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要: 星形胶质细胞上调基因-1(astrocyte elevated gene-1,AEG-1)在多种肿瘤中过表达,参与肿瘤的形成、转移等过程。本实验利用CRISPR/Cas9技术敲除AEG-1基因并研究其在胶质瘤细胞转移过程中的作用。首先设计构建sgRNA/Cas9二合一表达载体并转染到人胶质瘤U251细胞中,通过TA克隆测序鉴定sgRNA的活性;然后筛选建立稳定的AEG-1敲除U251细胞系,并利用Western blot实验检测AEG-1的敲除效率;最后利用Transwell小室、划痕实验评价AEG-1敲除后对肿瘤细胞迁移能力的影响。结果显示,成功构建靶向敲除AEG-1基因的sgRNA/Cas9二合一表达载体,所构建的载体与实验设计相一致,通过TA克隆测序鉴定sgRNA有活性;成功建立稳定的AEG-1敲除U251细胞系,Western blot实验结果表明敲除效率高达98%;Transwell小室实验、划痕实验结果表明AEG-1敲除U251细胞系的转移能力明显降低。
分类: 生物学 >> 生物工程 提交时间: 2018-04-19 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要: 目的:应用CRISPR/Cas9技术构建去泛素化酶YOD1基因敲除小鼠。方法:针对YOD1基因设计单链向导RNA(sgRNA)识别序列,构建sgRNA质粒,与Cas9质粒体外转录、纯化后注射入受精卵,通过PCR和测序验证得到F0代阳性小鼠。配繁两代后,取同窝对照的野生型(WT)和敲除(KO)小鼠的主要组织器官研磨,使用免疫印迹(WB)技术检测各组织YOD1蛋白的表达,确证YOD1敲除小鼠模型是否成功建立。统计YOD1杂合子(HET)自交存活后代各基因型比例,分析是否有胚胎致死表型。解剖小鼠分析主要组织器官的表型,进一步利用H.E.染色分析KO小鼠是否存在自发的病理改变。通过血糖耐受实验(GTT)分析KO小鼠的血糖调控能力。结果:基因组测序和WB检测结果显示KO小鼠中YOD1被明显敲除,YOD1敲除小鼠模型成功建立。YOD1杂合子自交后代各基因型比例符合孟德尔定律,提示KO小鼠非胚胎致死。YOD1敲除小鼠肝脏显著小于WT小鼠。GTT结果表明敲除YOD1不影响小鼠的血糖稳态。结论:应用CRISPR/Cas9技术成功构建YOD1基因敲除小鼠。KO小鼠正常出生,无任何胚胎发育缺陷。与WT小鼠相比,KO小鼠肝脏显著减小,但无显著的自发病理变化,KO小鼠血糖控制亦无显著差异。
分类: 生物学 >> 生物工程 提交时间: 2017-11-21 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要: CRISPR / Cas9系统是细菌体在长期进化过程中抵御病毒或噬菌体DNA的一种适应性免疫系统。尽管近年来的一些基因编辑技术,例如锌指核酸酶、转录激活因子效应物核酸酶等,已经给基因编辑带来了许多便利。但CRISPR / Cas9系统以其独特的优势,给基因编辑领域带来了革命性的变化。CRISPR / Cas9系统在生物研究、基因相关疾病的治疗、疾病的基因水平研究等多方面都有广泛的应用。本文综述近年来CRISPR / Cas9运输系统的研究进展及其在基因相关疾病方面取得的应用成果,分析慢病毒和腺相关病毒运载基因编辑元件的利弊,并探讨CRISPR / Cas9系统在基因编辑效率方面的影响因素及仍然存在的问题。
分类: 生物学 >> 生物工程 提交时间: 2017-11-21 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要: 目的 运用CRISPR/Cas9基因编辑技术,建立miR-362基因敲除的95-D肺癌细胞株,并研究miR-362在肿瘤中的调控作用。方法 针对人源miR-362基因序列设计gRNA,构建px330-gRNA载体;T7E1 assay确定gRNA的有效性。分别扩增miR-362上下游同源臂序列构建donor载体。利用脂质体将CRISPR系统和donor载体共转至人肺癌细胞系95-D,通过同源重组方法将筛选标志基因整合至基因组中,通过流式分选以及qPCR方法检测筛选出的细胞中miR-362表达水平。利用Transwell分析miR-362对细胞运动能力的影响。结果 与95-D细胞相比, 95-D-KnockDown细胞中miR-362表达水平显著降低,且迁移侵袭能力分别下降了53.1%(p=0.0006)和48.3% (p=0.0002)。结论 利用CRISPR/Cas9系统成功构建了miR-362基因敲除的95-D细胞,miR-362可促进细胞的运动能力,为后续研究miR-362在肿瘤中的作用机制和功能奠定了基础。
分类: 生物学 >> 生物工程 提交时间: 2017-11-21 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要: CRISPR / Cas9系统是细菌体在长期进化过程中抵御病毒或噬菌体DNA的一种适应性免疫系统。尽管近年来的一些基因编辑技术,例如锌指核酸酶、转录激活因子效应物核酸酶等,已经给基因编辑带来了许多便利。但CRISPR / Cas9系统以其独特的优势,给基因编辑领域带来了革命性的变化。CRISPR / Cas9系统在生物研究、基因相关疾病的治疗、疾病的基因水平研究等多方面都有广泛的应用。本文综述近年来CRISPR / Cas9运输系统的研究进展及其在基因相关疾病方面取得的应用成果,分析慢病毒和腺相关病毒运载基因编辑元件的利弊,并探讨CRISPR / Cas9系统在基因编辑效率方面的影响因素及仍然存在的问题。
分类: 生物学 >> 生物工程 提交时间: 2017-11-21 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要: 目的 运用CRISPR/Cas9基因编辑技术,建立miR-362基因敲除的95-D肺癌细胞株,并研究miR-362在肿瘤中的调控作用。方法 针对人源miR-362基因序列设计gRNA,构建px330-gRNA载体;T7E1 assay确定gRNA的有效性。分别扩增miR-362上下游同源臂序列构建donor载体。利用脂质体将CRISPR系统和donor载体共转至人肺癌细胞系95-D,通过同源重组方法将筛选标志基因整合至基因组中,通过流式分选以及qPCR方法检测筛选出的细胞中miR-362表达水平。利用Transwell分析miR-362对细胞运动能力的影响。结果 与95-D细胞相比, 95-D-KnockDown细胞中miR-362表达水平显著降低,且迁移侵袭能力分别下降了53.1%(p=0.0006)和48.3% (p=0.0002)。结论 利用CRISPR/Cas9系统成功构建了miR-362基因敲除的95-D细胞,miR-362可促进细胞的运动能力,为后续研究miR-362在肿瘤中的作用机制和功能奠定了基础。
分类: 生物学 >> 生物工程 提交时间: 2017-07-24 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要: 近些年CRISPR/Cas9基因编辑技术已广泛应用于作物遗传育种中,经过拷贝数筛选得到的单拷贝基因编辑株系,可以进行遗传分离获得具有改良性状但不携带外源基因成分的非转基因植株,消除转基因安全性的风险。目前拷贝数的检测主要采用Southern杂交,但是该方法存在操作复杂,需要相对大量的植物材料等缺点,不能进行高通量的筛选。为建立简便高效的基因编辑番茄植株中外源基因拷贝数的检测体系,以内源性基因APX(抗坏血酸过氧化物酶基因)作为内参基因,外源性基因HPT(潮霉素磷酸转移酶基因)作为目的基因,利用Taqman法的实时荧光定量PCR技术,检测有12株PDS基因(八氢番茄红素脱氢酶基因)编辑番茄中外源抗性基因HPT的拷贝数为1,初步建立了一种检测基因编辑植株中外源基因整合拷贝数的方法,为快速可靠的筛选单拷贝改良株系奠定了一定的技术基础。
分类: 生物学 >> 生物工程 提交时间: 2017-07-24 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要: CRISPR/Cas9系统的发展彻底改变了人们编辑DNA序列和调控目标基因表达水平的能力,从而为生物体的精确基因组编辑提供了有力的工具。简化后的CRISPR/Cas9系统由两部分组成:Cas9蛋白和sgRNA。其作用原理为sgRNA通过自身的Cas9把手与Cas9蛋白形成Cas9-sgRNA复合体,Cas9-sgRNA复合体中sgRNA的碱基互补配对区序列与目标基因的靶序列通过碱基互补配对原则进行配对结合,Cas9利用自身的核酸内切酶活性对目标DNA序列进行切割。与传统的基因组编辑技术相比,CRISPR/Cas9系统具有几大明显的优势:易用性、简便性、低成本、可编程性以及可同时编辑多个基因。CRISPR/Cas9基因组编辑技术以及衍生出来的CRISPRi和CRISPRa基因表达调控技术已经被广泛应用于多种真核和原核生物中。该文综述了CRISPR/Cas9系统的起源、作用机理、在生物体中的应用和其衍生出的技术,并概述了其脱靶效应和未来前景。
分类: 生物学 >> 生物物理学 >> 细胞生物学 提交时间: 2016-05-12
摘要: The CRISPR/Cas system has proven to be a powerful gene editing tool both in vitro and in vivo. A recent flurry of studies of in vivo gene editing using the CRISPR/Cas system bring bright prospects in creating animal models and targeted gene therapy of human genetic diseases.
分类: 生物学 >> 生物物理学 >> 细胞生物学 提交时间: 2016-05-12
摘要: Nuclease-based gene editing technologies have opened up opportunities for correcting human genetic diseases. For the first time, scientists achieved targeted gene editing of mitochondrial DNA in mouse oocytes fused with patient cells. This fascinating progression may encourage the development of novel therapy for human maternally inherent mitochondrial diseases.
分类: 生物学 >> 植物学 >> 植物学研究、实验与植物演化、发展 提交时间: 2016-05-03
摘要: CRISPR-Cas9 system is now widely used to edit a target genome in animals and plants. Cas9 protein derived from Streptococcus pyogenes (SpCas9) cleaves double-stranded DNA targeted by a chimeric single-guide RNA (sgRNA). For plant genome editing, Agrobacterium-mediated T-DNA transformation has been broadly used to express Cas9 proteins and sgRNAs under the control of CaMV 35S and U6/U3 promoter, respectively. We here developed a simple and high-throughput binary vector system to clone a 19−20 bp of sgRNA, which binds to the reverse complement of a target locus, in a large T-DNA binary vector containing an SpCas9 expressing cassette. Two-step cloning procedures: (1) annealing two target-specific oligonucleotides with overhangs specific to the AarI restriction enzyme site of the binary vector; and (2) ligating the annealed oligonucleotides into the two AarI sites of the vector, facilitate the high-throughput production of the positive clones. In addition, Cas9-coding sequence and U6/U3 promoter can be easily exchanged via the GatewayTM system and unique EcoRI/XhoI sites on the vector, respectively. We examined the mutation ratio and patterns when we transformed these constructs into Arabidopsis thaliana and a wild tobacco, Nicotiana attenuata. Our vector system will be useful to generate targeted large-scale knock-out lines of model as well as non-model plant.