应用CRISPR/Cas9技术构建miR-362敲除的95-D肺癌细胞株

摘要: 目的 运用CRISPR/Cas9基因编辑技术，建立miR-362基因敲除的95-D肺癌细胞株，并研究miR-362在肿瘤中的调控作用。方法 针对人源miR-362基因序列设计gRNA，构建px330-gRNA载体；T7E1 assay确定gRNA的有效性。分别扩增miR-362上下游同源臂序列构建donor载体。利用脂质体将CRISPR系统和donor载体共转至人肺癌细胞系95-D，通过同源重组方法将筛选标志基因整合至基因组中，通过流式分选以及qPCR方法检测筛选出的细胞中miR-362表达水平。利用Transwell分析miR-362对细胞运动能力的影响。结果 与95-D细胞相比， 95-D-KnockDown细胞中miR-362表达水平显著降低，且迁移侵袭能力分别下降了53.1%（p=0.0006）和48.3% （p=0.0002）。结论 利用CRISPR/Cas9系统成功构建了miR-362基因敲除的95-D细胞，miR-362可促进细胞的运动能力，为后续研究miR-362在肿瘤中的作用机制和功能奠定了基础。