分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2018-09-13 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 为了促进亮氨酸脱氢酶在Bacillus subtilis中高效表达，采取在质粒pMA5自带的启动子PHpaII之后分别添加诱导型和组成型启动子，考察双启动子对酶表达的影响。选取2种诱导型启动子（Pgrac、Pgl-M1）和4种组成型启动子（P43、Plaps、PHpaII、PamyQ）进行构建表达，其中组成型启动子PamyQ与PHpaII构成的双启动子效果最好，有效地将胞外活性提高到31.24 UmL-1，是单启动子PHpaII的3.4倍。在以上最优双启动子的基础上分别融合Sec途径和Tat途径的4种信号肽，但信号肽与双启动子共同作用并没有获得更高的酶活性。选用酶活最高的双启动子突变菌株Bacillus subtilis 168/pW6（PHpaII-PamyQ）进行7.5 L发酵罐补料发酵产酶研究，LeuDH酶活达到217.96 UmL-1，是摇瓶水平的6.97倍，对工业上产亮氨酸脱氢酶有一定参考价值。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2018-01-15 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 根据信号肽N端电荷数，选择Sec及Tat两种途径的信号肽构建枯草芽孢杆菌穿梭质粒，首次实现Bacillus cereus源亮氨酸脱氢酶基因在Bacillus subtilis中的分泌表达。Tat途径信号肽PhoD促进蛋白分泌的效果最好，胞外酶活力达20.25U/ml，为不添加信号肽的2.2倍，信号肽N端较多的电荷数，可能有利于多聚体蛋白的分泌。对表达产物进行纯化和酶学性质测定。结果表明，纯酶比酶活为13U/mg；L-Leucine为底物时酶的Km为6.17mM，Vmax为14.49umol·min-1·mg-1；底物特异性研究发现，酶与天然底物L-Leucine的亲和性最好，对一些脂肪族氨基酸也有活性，对芳香族氨基酸L-Phenylalanine无活性；酶的最适pH为10.5~12，pH稳定范围为5.0-11.0；最适反应温度为55℃；圆二色谱变温扫描酶二级结构变化，α螺旋含量随温度升高逐渐降低；差示扫描微量热技术(DSC)测定酶的解折叠温度（Tm值）为64.13℃，表明该酶具有较好耐热性。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2017-07-24 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 木聚糖酶和甘露聚糖酶是两种主要的半纤维素酶，广泛应用于诸多领域。本研究选择了3种毕赤酵母内源信号肽Scw11、Dse4和Exg1，以α-factor为参照，分别在毕赤酵母X33中用于表达实验室前期获得的耐热木聚糖酶DSB和耐热甘露聚糖酶ManA，选择适合DSB和ManA表达的信号肽以提高胞外酶活水平。结果表明不同信号肽引导的两种半纤维素酶的酶活水平相差较大：对DSB（分子量为23 KDa），α-factor介导的表达效率明显优于其它3种信号肽；但对ManA（分子量为30 KDa），Dse4和α-factor介导的表达效率相当且明显优于Scw11和Exg1。因此在X33中表达DSB时应选用α-factor，而表达ManA时应选用Dse4或α-factor。此外胞内酶活的结果显示α-factor介导的DSB和ManA重组菌胞内滞留酶活明显高于其它信号肽，而分子量为30 KDa的ManA的滞留酶活又明显高于分子量为23 KDa的DSB，因此在表达ManA蛋白时，选用其它的信号肽，如Dse4，会减少外源蛋白在胞内的滞留从而在一定程度上提高外源蛋白的分泌量。本研究为毕赤酵母表达系统鉴定更多可用的信号肽并筛选到针对目的蛋白的最优信号肽奠定了一定的基础。
点击量
点击量
下载量
评论
