分枝杆菌细胞裂解液催化甾体激素C1,2位脱氢反应的研究

摘要: 9β,11β-环氧-17α,21-二羟基-16β-甲基孕-1,4-二烯-3,20-二酮（Ⅳ）是生产9-氟甾体激素的关键前体，以9β,11β-环氧-17α,21-二羟基-16β-甲基孕-4-烯-3,20-二酮-21-醋酸酯（Ⅰ）为底物合成Ⅳ是工业化生产Ⅳ的重要方法。通过比较分枝杆菌全细胞转化法与细胞裂解液转化法，发现分枝杆菌全细胞只能将Ⅰ转化9β,11β-环氧-17α,21-二羟基-16β-甲基孕-4-烯-3,20-二酮（Ⅱ），而细胞裂解液可以有效地将Ⅰ转化为Ⅳ，其反应机制为底物Ⅰ自发水解为中间体Ⅱ，Ⅱ在C1,2位脱氢酶（KSTD）的催化作用下发生C1,2位脱氢反应生成产物Ⅳ。为进一步提高产物Ⅳ的生成率，利用基因工程手段在分枝杆菌中分别过表达编码KSTD的关键基因：kstD、kstD3和kstDM，提高脱氢反应效率，结果表明1 g/L底物Ⅰ在pH 7.0的重组菌株MS136-kstDM细胞裂解液中反应45 h，Ⅳ的生成率为78.4 %，比出发菌株提高了38.9％；并优化缓冲液pH，提高反应速率，结果表明1 g/L底物Ⅰ在pH 7.5的重组菌株MS136- kstDM细胞裂解液中反应45 h，Ⅳ的生成率为92.8 %，比出发菌株提高了63.4 %。