分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2018-05-16 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 利用hiTAIL-PCR(High efficient thermal asymmetric interlaced PCR)法扩增获得了转基因水稻BPL9K-2的外源基因插入位点的左旁侧序列450 bp，与水稻参考基因组数据比对发现其左边界插入在水稻基因组第10号染色体短臂的1037765位核苷酸残基之后。根据水稻参考基因组序列和外源基因右边界序列，设计引物扩增得到485 bp的特异片段，通过数据库比对发现其右边界插入在水稻基因组第10号染色体短臂的1037825位核苷酸残基之前。因为外源基因插入和非正常重组，水稻基因组上缺失了59个核苷酸。基于左右旁侧序列，建立了转基因水稻BPL9K-2的事件特异性定性PCR检测方法，可以分别扩增到片段大小为449 bp和485 bp的特异条带。该方法特异性好，灵敏度高，能够在BPL9K-2基因组DNA相对含量为0.1%的模板中检测出转基因成份。依据旁侧序列，建立了快速鉴定转基因后代植株外源基因型的三引物PCR检测方法。这些方法的建立，为转基因水稻BPL9K-2的应用和检测提供了技术支持。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2018-05-16 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 生物基产品是指以可再生资源（如农业和林业残渣、有机废料等）为原料而生产的化工产品和绿色能源，因其环境友好的优越性已成为社会经绿色可持续发展的重要途径。近年来，欧美等发达国家纷纷出台战略政策促进生物基产业的发展。欧盟委员会对生物基的研究与创新（R&I）项目给予了政策与财政的重点支持，已经逐渐形成以BBI（Bio-Based Industries）计划为核心的管理与资助体系。本文通过对欧盟生物基R&I项目的资助框架和经费分配情况的调研与分析，发现欧盟实现生物基经济目标的具体措施和实践方案，我国生物基创新行动提出决策建议。同时，BBI计划作为欧盟新兴产业R&I体系建设的典型案例，对我国其他创新方向开展科技政策与管理机制改革也具有一定的参考价值。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2018-05-16 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： β2糖蛋白Ⅰ ( beta 2- glycoprotein Ⅰ，β2GPⅠ ) 是抗磷脂综合征(antiphospholipid syndrome，APS) 血清中抗磷脂抗体(antiphospholipid antibody，aPL)的主要抗原。β2GPⅠ 通过第五结构域与阴性磷脂oxLDL结合，进而被aPL识别，是APS动脉血栓发生的关键事件。本研究构建了编码β2GPⅠ第五结构域（ß2GPⅠ-DⅤ）、ß2GPⅠ-DⅤ突变体及ß2GPⅠ-DⅤ的Phe280-Ala320片段的原核表达载体，对其进行诱导表达和纯化，解析了ß2GPⅠ-DⅤ与阴性磷脂结合的分子机制，结果表明，β2GPI-DV中Cys281-Cys288以及Ser311-Lys317区段在空间上维持一定构型是与CL结合所必须的前体条件，而C245-C296，C288-C326两个二硫键在维持二者空间构型方面起到一定的作用。在此基础上，我们进一步检测了具有结合CL生物学活性的rDV结合oxLDL以及APS血清中oxLDL的活性，表明rDV具有与天然β2GPⅠ相一致的生物学活性。本研究获得的rß2GPⅠ-DⅤ，以及与oxLDL结合的方法体系的建立，为APS早期实验室诊断奠定基础。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2018-05-16 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： (S)-6-氯-3-羰基-5-羟基己酸叔丁酯（(S)-CHOH）是他汀类药物合成的关键手性中间体。利用醇脱氢酶催化6-氯-3,5-二羰基己酸叔丁酯不对称合成(S)-CHOH是很有潜力的制备路线，目前存在的主要问题是醇脱氢酶催化活性较低。首先对来源于Lactobacillus kefir DSM 20587的醇脱氢酶的四点突变体LkTADH（A94T/F147L/A202L/L199H）进行回复突变，确定了关键位点147和202位，并获得比酶活提高1倍的突变体M F147L-A202L。对这两个位点进行饱和突变，获得比酶活比LkTADH提高1.47倍的突变体M F147I-A202L。其比酶活为10.17U/mg，为目前文献报道最高水平。通过动力学分析和分子对接，分析了突变位点对酶活影响的机理，为后续研究奠定了良好的基础。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2018-05-16 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 近年来，哺乳动物细胞培养技术发展迅猛，基于此技术的生物制药行业更是异军突起。在激烈的生物药市场竞争中，缩短研发时间和降低研发成本是制胜的关键。与传统的生物反应器相比，高通量微型生物反应器具有操作简单、运行通量高、实验重复性好等优点，可大大缩短研发周期，降低人力、物力成本，因此成为了生物制药行业最新的研究热点之一。目前，已成功应用于生物药物研发的微型生物反应器有SimcellTM、Ambr 15TM、Ambr 250TM等，分别适用于工艺开发中的不同阶段。本文将以这三种微型生物反应器为例，介绍高通量微型反应器在哺乳动物细胞培养工艺开发中的研究现状及发展前景。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2018-05-16 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 细胞穿膜肽（Cell-penetrating peptide,CPP）作为一种体内大分子药物跨膜运输载体被广泛研究和应用。中期因子Midkine（MK）是人体的一种带有肝素结合域（Heparin-Binding Domain，HBD）的生长因子。本文报道了MK中HBD的部分富含碱性氨基酸的基因序列（命名为MK-S0）与绿色荧光蛋白（EGFP）基因融合表达后，能将EGFP有效地转运入胞内，且其穿膜转运效率高于经典穿膜肽Tat。将MK-S0序列进行进一步突变优化改造得到的MK-∆4，其穿膜效率比天然序列来源的MK-S0提高16倍以上，且MK-∆4的穿膜转运作用适用于多种肿瘤细胞。穿膜机理分析研究结果显示，MK-∆4可与细胞表面硫酸乙酰肝素结合，随之以巨胞饮形式内吞入胞。采用MTT方法检测的细胞生长抑制试验结果显示，连接有MK-∆4的苦瓜来源的核糖体失活蛋白MAP30比单独的MAP30对HeLa肿瘤细胞的IC50值降低5.8倍，大大提高了这种药物蛋白抑杀肿瘤细胞的效果。由此表明，源于MK的这种经过突变改造的MK-∆4，可作为一种新型高效的细胞穿膜肽，将药物蛋白有效运输到细胞内发挥抗肿瘤效应。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2018-05-16 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 目的借助实验室前期质谱分析技术和数据分析研究基础，采用免疫共沉淀(Co-IP)和蛋白沉降实验(GST pull-down)验证HBV X蛋白与Tab1蛋白的相互作用，为进一步研究HBx在HBV慢性感染致癌机制中的作用提供一定的实验依据。方法成功构建pGEX-2TK-GST-HBx质粒，对GST-HBx融合蛋白进行诱导表达，与GST-beads结合孵育，构建pcDNA3.1/myc-His(-)B-Tab1，转染293T细胞使其表达，然后GST pull-down体外试验验证二者的相互作用；构建pcDNA3.1/myc-His(-)B-Tab1和pcDNA3.1-3×flag-HBx真核表达质粒, 共转染293T和HepG2细胞使其表达，通过Co-IP实验验证抗Myc抗体可以将HBx从细胞裂解液中沉淀下来，证实了它们在两种细胞系中存在相互作用。 结果显示了HBx和Tab1在体内外条件下能够发生相互作用，为进一步明确HBV X蛋白功能及作用机制奠定基础。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2018-05-16 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 目的：慢病毒载体(Lentiviral vector ，LVV)是一种有效的基因治疗导入系统。本研究拟用已研发的携带人的β-珠蛋白基因自删除慢病毒载体，优化其表达有效性和提高其病毒颗粒数。方法：首先，比较三款不同的启动子预测软件的分析结果，分别构建三种不同长度启动子的表达β-珠蛋白基因（β-globin）的LVV，并对其Ⅱ号内含子进行部分删减；用经优化的LVV转导β-地中海贫血（β-地贫）的小鼠诱导性多能性干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSC）后，进而用此iPSC制备嵌合体小鼠模型；经RT-PCR、血涂片瑞氏吉姆萨染色等观察分析其功能性代偿的潜能。研究结果：经优化后的自删除慢病毒载体病毒对其病毒颗粒数的滴度影响不大（2.3×1011PLs/ml），可在嵌合体小鼠模型体内检测到正常人β-珠蛋白基因的功能性表达。结论：优化了表达人β-珠蛋白基因的自删除LVV。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2018-05-16 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 目的：利用昆虫细胞表达系统生产重组的人增殖细胞核抗原（Proliferating cell nuclear antigen, PCNA），并进行纯化和抗体结合特性鉴定。方法：以HeLa细胞逆转录的cDNA为模板，扩增人PCNA基因，并插入杆状病毒载体AcMNPV。利用昆虫细胞得到PCNA基因的重组杆状病毒。病毒感染细胞表达蛋白，联合镍柱亲和层析和离子交换层析获得高纯度的重组人PCNA蛋白。ELISA法测定抗体结合特异性。结果：以HeLa细胞cDNA为模板得到的基因序列同GenBank的人PCNA基因序列一致。草地贪夜蛾细胞（Spodoptera frugiperda, Sf9）表达重组人PCNA（Recombinant human PCNA, rPCNA）的最佳感染值（MOI）和感染时间分别为0.05和144 h。rPCNA的产量高达110 mg/L细胞，纯度> 95％。间接ELISA法检测抗体结合特性，rPCNA的敏感性和特异性分别为93.3％和85.0％。结论：建立了rPCNA的表达和纯化方法，获得了高效表达、高度抗体结合特异性的PCNA蛋白，该蛋白能进一步开发为PCNA相关疾病的体外诊断试剂盒，具较大的应用价值。
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