白藜芦醇通过沉默调节蛋白1-解偶联蛋白2信号通路降低小鼠睾丸间质细胞TM3的氧化损伤

摘要: 本试验旨在研究白藜芦醇（RES）对氧化损伤小鼠睾丸间质细胞TM3的保护作用，并探索其可能的作用机制。首先，用不同浓度（0、150、200、250、300 μmol/L）的过氧化氢（H2O2）处理小鼠睾丸间质细胞TM3 8 h，确定建立氧化损伤细胞模型的适宜H2O2浓度。用适宜浓度的H2O2建立氧化损伤细胞模型；然后，用不同浓度（0、2.5、5.0和10.0 μmol/L）的RES分别处理正常细胞和氧化损伤细胞24 h，确定RES安全浓度；最后，用安全浓度的RES处理氧化损伤细胞24 h。在整个培养过程中采用iCELLigence实时无标记细胞功能分析仪监测细胞的增殖情况；待安全浓度的RES处理氧化损伤细胞结束后采用2',7'-二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）探针法检测细胞中活性氧（ROS）的含量，实时荧光定量PCR（RT-qPCR）和蛋白质印迹（Western blotting）法分别检测沉默调节蛋白1(SIRT1)/UCP2信号通路中关键因子SIRT1和UCP2 mRNA和蛋白质的相对表达量。结果表明：1）用浓度为150 μmol/L及以上的H2O2处理细胞8 h后，极显著降低细胞存活率（P<0.01），因此确定150 μmol/L为建立氧化损伤细胞模型的适宜H2O2浓度。2）用10.0 μmol/L及以下浓度的RES处理正常细胞24 h后，细胞存活率均无显著变化（P>0.05）；用2.5、5.0和10.0 μmol/L的RES处理氧化损伤细胞24 h后，细胞存活率均显著提高（P<0.05），且各浓度RES组间无显著差异（P>0.05）。因此，选用5.0 μmol/L为RES的安全浓度。3）用5.0 μmol/L的RES处理氧化损伤细胞24 h后，细胞中ROS的含量较极显著降低（P<0.01）；细胞中SIRT1 mRNA和蛋白质的相对表达量极显著增加（P<0.01），而UCP2 mRNA和蛋白质的相对表达量则显著或极显著降低（P<0.01或P<0.05）。由此可见，适宜浓度的RES可激活SIRT1同时抑制UCP2的表达，UCP2通过负反馈调节方式减少细胞内ROS的生成，从而在一定程度上抑制TM3细胞的氧化损伤。