分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2018-12-25 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 目的：探究小干扰RNA(small interference RNA，siRNA)介导的骨形态发生蛋白7(bone morphogenetic protein7,BMP7)基因沉默对钙盐诱导猪主动脉瓣膜间质细胞成骨分化的影响及机制，为钙化性主动脉瓣膜病（calcific aortic valve disease，CAVD）的干预及治疗提供理论依据。 方法：非CAVD瓣膜组织(non-CAVD组)取自手术治疗的主动脉夹层患者，CAVD瓣膜组织(CAVD组)取自因钙化性主动脉瓣狭窄而进行主动脉瓣膜置换术的患者，采用免疫组化和Western blot法检测non-CAVD组和CAVD组中BMP7、Runt相关转录因子2(Runx2)的蛋白表达水平。选取健康家猪处死后即刻于无菌条件下取主动脉瓣叶，采用胶原酶连续消化法分离主动脉瓣膜间质细胞，观察其形态特征，并用免疫荧光染色行表型鉴定。采用脂质体转染法将BMP7-siRNA转染猪主动脉瓣膜间质细胞，采用qPCR和Western blot法验证BMP7表达的变化;利用钙盐培养基诱导细胞成骨分化，建立体外主动脉瓣膜间质细胞钙化模型后，采用ALP染色和茜素红S染色实验分别检测细胞早期及晚期成骨分化能力;采用qPCR和Western blot法分别检测细胞成骨相关基因及蛋白Runx2、OCN和OPN的表达情况。并用Western blot法检测BMP7下游信号通路中Smad1/5/8的磷酸化水平。结果：BMP7和Runx2蛋白在CAVD组中表达明显高于non-CAVD组。成功分离出原代猪主动脉瓣膜间质细胞，α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）及波形蛋白（vimentin）染色阳性，血管性血友病因子（von Willebrand factor，vWF）染色阴性。转染BMP7-siRNA后猪主动脉瓣膜间质细胞中BMP7的mRNA和蛋白水平均明显下调，早期及晚期成骨分化能力均明显降低。沉默BMP7基因的表达，可下调Runx2、OCN和OPN的基因及蛋白表达，且磷酸化的Smad1/5/8(p-Smad1/5/8)蛋白水平明显降低。结论：BMP7基因沉默抑制钙盐诱导的主动脉瓣膜间质细胞的成骨分化能力，BMP7/Smads信号通路可能在该过程中发挥重要作用。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2017-07-24 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 、摘要 目的：分析和确认转录因子DLX1在骨形态发生蛋白9（Bone Morphogenetic Protein 9, BMP9）诱导的间充质干细胞C3H10T1/2成骨分化中的作用。方法： 首先，BMP9腺病毒感染C3H10T1/2细胞，RT-PCR和Western Blot检测下DLX1表达变化；随后，利用重组腺病毒技术分别过表达DLX1和RNA干扰（RNA Intenference, RNAi）抑制DLX1的表达，并利用碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase, ALP)染色、钙盐沉积实验（茜素红染色），免疫细胞化学检测骨钙素（Osteocalcin, OCN）表达和裸鼠皮下异位成骨实验分析DLX1对于BMP9诱导的C3H10T1/2细胞成骨分化的影响。荧光素酶报告基因实验和Western Blot分析DLX1对于BMP9诱导的C3H10T1/2细胞Smad1/5/8信号途径的影响。结果：BMP9可以促进C3H10T1/2细胞中DLX1基因和蛋白表达水平；过表达DLX1在体外可进一步促进BMP9诱导的C3H10T1/2细胞的ALP活性、钙盐沉积以及OCN的表达，过表达DLX1亦可促进BMP9诱导的裸鼠皮下异位成骨；反之，RNAi抑制DLX1表达后，由BMP9诱导的C3H10T1/2细胞的ALP活性、钙盐沉积、OCN表达和裸鼠皮下异位成骨均相应均受到抑制。过表达DLX1可进一步增强BMP9诱导的C3H10T1/2细胞中Smad/1/5/8的转录调控活性，RNAi降低DLX1表达则可抑制BMP9诱导Smad/1/5/8的转录调控活性。但是，无论过表达DLX1和RNAi降低DLX1表达均不会对BMP9诱导的Smad/1/5/8磷酸化造成影响。结论：DLX1可以调节BMP9诱导的间充质干细胞C3H10T1/2细胞成骨分化，其调节作用可能是通过影响Smad1/5/8信号的转录调控活性而实现的。
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