分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2018-09-13 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 为了促进亮氨酸脱氢酶在Bacillus subtilis中高效表达，采取在质粒pMA5自带的启动子PHpaII之后分别添加诱导型和组成型启动子，考察双启动子对酶表达的影响。选取2种诱导型启动子（Pgrac、Pgl-M1）和4种组成型启动子（P43、Plaps、PHpaII、PamyQ）进行构建表达，其中组成型启动子PamyQ与PHpaII构成的双启动子效果最好，有效地将胞外活性提高到31.24 UmL-1，是单启动子PHpaII的3.4倍。在以上最优双启动子的基础上分别融合Sec途径和Tat途径的4种信号肽，但信号肽与双启动子共同作用并没有获得更高的酶活性。选用酶活最高的双启动子突变菌株Bacillus subtilis 168/pW6（PHpaII-PamyQ）进行7.5 L发酵罐补料发酵产酶研究，LeuDH酶活达到217.96 UmL-1，是摇瓶水平的6.97倍，对工业上产亮氨酸脱氢酶有一定参考价值。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2018-01-15 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 根据信号肽N端电荷数，选择Sec及Tat两种途径的信号肽构建枯草芽孢杆菌穿梭质粒，首次实现Bacillus cereus源亮氨酸脱氢酶基因在Bacillus subtilis中的分泌表达。Tat途径信号肽PhoD促进蛋白分泌的效果最好，胞外酶活力达20.25U/ml，为不添加信号肽的2.2倍，信号肽N端较多的电荷数，可能有利于多聚体蛋白的分泌。对表达产物进行纯化和酶学性质测定。结果表明，纯酶比酶活为13U/mg；L-Leucine为底物时酶的Km为6.17mM，Vmax为14.49umol·min-1·mg-1；底物特异性研究发现，酶与天然底物L-Leucine的亲和性最好，对一些脂肪族氨基酸也有活性，对芳香族氨基酸L-Phenylalanine无活性；酶的最适pH为10.5~12，pH稳定范围为5.0-11.0；最适反应温度为55℃；圆二色谱变温扫描酶二级结构变化，α螺旋含量随温度升高逐渐降低；差示扫描微量热技术(DSC)测定酶的解折叠温度（Tm值）为64.13℃，表明该酶具有较好耐热性。
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