分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2018-01-16 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： SUMO蛋白酶（Ulp1）是切割小分子泛素修饰（SUMO）融合蛋白获得天然N端靶蛋白的一种工具酶，具有酶切效率高，特异性好等优点。但现有市售SUMO蛋白酶Ulp1价格昂贵，操作复杂，限制了SUMO融合体系的运用。利用基因工程技术，合成基因ulp1（Leu403-Lys621），并在N端和C端加入多聚组氨酸标签（His6），构建重组表达载体psvT7-ulp1，将重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)和BL21 trxB(DE3)中。经过高通量筛选技术快速确定最优的表达条件为采用BL21(DE3)作为表达宿主，转接后7 h加入IPTG，IPTG的终浓度为0.1 mmol/L，诱导时间为16 h，最终蛋白表达量占菌体总蛋白的34.5%，重组蛋白Ulp1的表达量为190mg/L，通过Ni-NTA一步纯化即可得到纯度95%以上的Ulp1。通过酶切反应，测定酶活为5.19 U/μl，比酶活为5.23×104 U/mg，是先前报道比酶活的1.87倍，通过酶活动力学分析，Ulp1的表观米氏常数 Km=0.359 g/L，Vm=5.10μg/(mL·min)。将SUMO融合表达体系用于单链抗体（Single-Chain Antibody Fragment，scFv）的表达，得到可溶的SUMO-scFv融合蛋白，使用表达的Ulp1进行酶切并纯化，获得纯度高于90%且N端不含多余氨基酸的scFv,操作步骤简单，显著改善了scFv在大肠杆菌中难于高效可溶性表达纯化的现状。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2018-01-16 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 纤维二糖可有效诱导丝状真菌产纤维素酶，前期研究表明匍枝根霉Rhizopus stolonifer TP-02具有纤维二糖合成酶（CBS），可以尿苷二磷酸葡萄糖（UDPG）为糖基供体合成纤维二糖，从而开启纤维素酶的自诱导合成途径。为研究R. stolonifer中纤维二糖的胞内合成途径，通过重叠PCR在GDP-葡糖焦磷酸化酶基因ggp中引入硫胺吡啶抗性基因ptrA，分别转化原菌TP-02和△ugp突变株，构建△ggp和△ugp/△ggp突变株。利用液质联用（LC-MS）检测突变株的胞内糖组分，发现ggp的缺失对胞内纤维二糖合成的影响较弱，而同时缺失ugp则将直接导致二糖合成受阻。RT-qPCR结果显示△ggp突变株中纤维素酶基因转录水平较原株TP-02下调20%左右，而△ugp/△ggp突变株中被测基因的转录水平则出现了高达80%左右的下调。同时对突变株纤维素酶表达水平进行研究，发现△ugp/△ggp突变株中几乎检测不到纤维素酶活力。结果显示，UDPG为R. stolonifer胞内合成纤维二糖的主要糖基供体，而GDPG可能是UDPG的替代物，在UDPG不足时维持胞内二糖合成。此外，利用生物信息学方法对CBS结构功能深入分析，经丙氨酸扫描确定其合成纤维二糖的关键作用残基为Asp210和Asp300，为后续进一步研究及理性改造提供方向和理论依据。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2018-01-16 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 目的：利用烟草遗传转化体系，研究尾叶桉（Eucalyptus urophylla）咖啡酸氧甲基转移酶基因（EuCOMT）和咖啡酰CoA氧甲基转移酶（EuCCoAOMT）基因对木质素单体合成的定向调控效果。方法：分别利用EuCOMT的正义片段、EuCCoAOMT的全长RNAi片段进行单基因和二价基因的烟草转化研究，并对转基因烟草植株中目标基因表达水平、木质素和纤维素的含量、茎部解剖结构以及木质素单体含量进行检测。结果：分别获得了转基因植株C-S（转EuCOMT正义片段）、CR（转EuCCoAOMT全长RNAi片段）、C-CR（EuCOM和EuCCoAOMT二价基因转化）。烟草中转入的正义EuCOMT的片段能够正常表达，而EuCCoAOMT的全长RNAi片段对烟草CCoAOMT基因引发了强烈的抑制。转基因烟草的生长形态、木质素、纤维含量以及解剖结构与野生型无显著差异。转基因植株C-S中G木质素含量升高17.72%，S/G比值降低17.99%；CR中S/G比值升高61.62%，C-CR中G木质素降幅达到57.38%，S/G比值升幅达到114.94%。结论：抑制CCoAOMT对G木质素合成具有显著的抑制效果，EuCOMT和EuCCoAOMT二价基因转化对S/G比值的定向调控效果最为理想。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2018-01-16 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 目的：通过优化PET11b-sTNFαRI 5’ mRNA翻译起始区（TIR）二级结构从而提高可溶性肿瘤坏死因子I型受体(sTNFαRI)在大肠杆菌(E.coli BL21(DE3))中的表达水平。方法：通过对PET11b-sTNFa RI mRNA 5’端TIR区二级结构的自由能及核苷酸位置熵分析，设计相应的引物对mRNA 5’翻译起始区（TIR）相应密码子进行突变，从而使核糖体结合位点（RBS）及起始密码子（AUG）暴露于发夹结构之外，此外将pET11b核糖体结合位点由GAAGGAGA突变为GAAGAA，以利于翻译复合体的组装以及翻译起始。通过基因克隆的方法将5’端TIR区优化后的序列与sTNFαRI序列一起克隆到pET11b载体中，并转化大肠杆菌BL21（DE3），阳性转化子经IPTG诱导表达，SDS-PAGE和Western-blot检测。结果：通过对PET11b-sTNFa RI 5’TIR mRNA二级结构优化， 经SDS-PAGE和Western-blot分析表明重组sTNF αRI的表达水平较优化前提高50-60%。结论：通过对重组载体翻译起始区（TIR）mRNA序列的二级结构优化可以有效提高目的蛋白的表达水平，对进一步工业化生产具有重要的应用价值。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2018-01-15 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 目的：从产品开发角度分析寡核苷酸类药物的发展现状和未来趋势。方法：检索科睿唯安（Clarivate Analytics）的Cortellis数据库的数据，利用定量分析法和对比分析法对检索结果进行分析。结果：目前已有7种寡核苷酸类药物上市，4种寡核苷酸类药物处于预注册及16种处于临床Ⅲ期，未来市场上的寡核苷酸类药物将呈现快速增长趋势。此外，寡核苷酸类药物的商业交易也越来越多，目前共发生包括药物开发及商业化许可、专利资产出售以及早期药物研发合作等10余起交易，其中药物开发及商业化许可是最主要的交易模式。结论：虽然寡核苷酸类药物市场尚处于起步阶段，但随着未来技术的不断发展改进，相信未来有更多的寡核苷酸类药物上市，为癌症及其他疾病的治疗提供新的契机。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2018-01-15 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 【背景】对虾白斑综合征病毒(White Spot Syndrome Virus ,WSSV)是对虾养殖业中危害最严重的病毒之一，至今尚无规模应用的有效药物防治方法。但近年来在WSSV免疫防治上进展较大。Vp28蛋白是WSSV囊膜上的主要结构蛋白，2004年以来其编码基因已在8种宿主中表达成功，在实验室试验中对WSSV的防治疗效显著，但目前尚未见到其在对虾产业中的应用。【目的】利用对虾的天然饵料聚球藻表达Vp28重组蛋白，这种药食同源可简化操作，降低成本，有助其在生产中应用。【方法】用荧光定量PCR方法检测转vp28基因聚球藻7942中vp28基因的表达效率。通过氧电极的方法测得转vp28基因型聚球藻在不同温度、光照、pH和盐度下的光合活性变化，找到它的最适生长条件。【结果】检测了vp28基因表达效率为9.52％，是在鱼腥藻7120表达效率的三倍。最适采收时间是对数生长后期（15d左右）。转基因型蓝藻7942的最适生长条件是：温度为40 ℃，盐度为0-0.1 mol Nacl /L，pH为7.5，光强450 μmol·m-2·s-1。【结论】本研究确定了vp28基因在聚球藻中的表达效率及该转基因藻的最适培养条件，这些研究结果为用转vp28基因型聚球藻7942规模制备药食同源的口服剂提供了依据。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2018-01-15 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 根据信号肽N端电荷数，选择Sec及Tat两种途径的信号肽构建枯草芽孢杆菌穿梭质粒，首次实现Bacillus cereus源亮氨酸脱氢酶基因在Bacillus subtilis中的分泌表达。Tat途径信号肽PhoD促进蛋白分泌的效果最好，胞外酶活力达20.25U/ml，为不添加信号肽的2.2倍，信号肽N端较多的电荷数，可能有利于多聚体蛋白的分泌。对表达产物进行纯化和酶学性质测定。结果表明，纯酶比酶活为13U/mg；L-Leucine为底物时酶的Km为6.17mM，Vmax为14.49umol·min-1·mg-1；底物特异性研究发现，酶与天然底物L-Leucine的亲和性最好，对一些脂肪族氨基酸也有活性，对芳香族氨基酸L-Phenylalanine无活性；酶的最适pH为10.5~12，pH稳定范围为5.0-11.0；最适反应温度为55℃；圆二色谱变温扫描酶二级结构变化，α螺旋含量随温度升高逐渐降低；差示扫描微量热技术(DSC)测定酶的解折叠温度（Tm值）为64.13℃，表明该酶具有较好耐热性。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2018-01-12 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 由于基础研究环境和临床环境之间存在的转化差异，使得药物在临床阶段取得成功仍然具有挑战性。诱导多能干(iPS)细胞的诞生为药物研发领域带来了新的希望，使研究者能在体外人性化各种药理学和毒理学模型。人iPS衍生细胞的可获得性，特别是可以定向分化成特定的功能性细胞，组织和器官，为疾病机制研究与细胞治疗提供了全新的途径。另一方面，转化研究中的生物标记物提供了评估临床前基础研究环境和临床环境下毒理学和药理学影响的可衡量的指标，而iPS细胞给生物标记物的研究带来了全新的思路。本综述从转化研究的角度概述了基于iPS细胞药物发现的现行策略，阐明iPS细胞的潜力以及生物标志物在药物发现和发展整个过程中的作用，突出在该领域有待改进的地方，以期为进一步相关性研究提供一定参考，为新药研发提供新的思路与方法。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2018-01-12 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 丝素蛋白（silk fibroin，SF）和壳聚糖（chitosan，CS）具有良好的生物相容性和可降解性，然而单一组分的SF和CS支架材料的诸多缺点限制了其在组织工程研究中应用。SF/CS复合材料克服单一组分SF和CS支架的缺点，具有力学性能优良、可塑性好、孔隙率及孔径可调和组分优势互补等特点。多种方法制备的SF/CS复合材料（微米/纳米颗粒、膜、纳米纤维、水凝胶和三维多孔支架）已被用于骨、软骨、皮肤、神经、脂肪、心脏和角膜等组织工程或组织损伤修复的研究中。目前，国内外对于SF/CS复合材料在组织工程中应用的研究尚处于起步阶段。本文主要对SF/CS复合材料的特点、制备方法以及在多种组织工程中应用的研究现状进行了简要介绍。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2018-01-12 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 对人源类溶菌酶蛋白6（human lysozyme-like protein 6，LYZL6）在受精过程中的作用进行研究，并对重组LYZL6蛋白（recombinant LYZL6，rLYZL6）的生理特性进行分析，从而揭示其生理功能。细胞免疫荧光法确定LYZL6定位于成熟精子头部的顶体后区域，反转录PCR（RT-PCR）分析表明精子表面的LYZL6蛋白来源于睾丸和附睾的分泌，Western blot法分析表明精子获能前后表面LYZL6的量无明显改变。半透明带结合实验和精子穿透实验分析表明兔抗LYZL6血清未明显抑制人精子结合透明带，但可明显抑制精卵融合。利用毕赤酵母表达系统成功表达了rLYZL6，使用甲壳素亲和层析和凝胶过滤层析可从发酵上清中纯化到具有生物活性的rLYZL6。酶联免疫吸附法（ELISA）分析显示rLYZL6不具有透明质酸结合能力、透明质酸水解能力和自由基清除活性，但具有较强的肽聚糖结合能力和异肽酶活性。LYZL6由睾丸和附睾分泌后定位于成熟精子头部的顶体后区域，可以参与精卵融合，并具有肽聚糖结合能力和异肽酶活性，提示LYZL6可能通过多种机制参与精子功能。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2018-01-11 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 随着分子生物学研究的进展，机体各种生物学特性的影响都在分子水平上寻求到原因。转录因子作为调节基因转录的重要蛋白，一直在被人们进行种类发掘及功能鉴定。KLF8 (Krüppel-like factor 8)是属于KLFs(Krüppel-like factors)家族中的一种转录因子[“基因是…..转录因子”？不对应]，在细胞侵袭和上皮-间质转化、细胞致癌性转化和肿瘤、细胞周期循环、脂肪细胞分化等方面有着深远影响。由于其在生物学功能上的多方面影响，使其逐渐成为科研人员探究的热点。对该转录因子的结构和作用已经有了深入的了解。现就KLF8基因与蛋白的分子结构和生物学特性研究进展进行综述，可为该基因作为遗传标记奠定基础并以期为相关研究如癌症调控、肥胖治疗及基础研究方面提供参考。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2018-01-11 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 植物半胱氨酸蛋白酶抑制剂在植物防御生物与非生物胁迫过程中发挥着重要的作用。拟南芥中的半胱氨酸蛋白酶抑制剂AtCYSa基因的表达能够受到多种胁迫的诱导，且在拟南芥中过量表达AtCYSa基因可以增强转基因拟南芥抵御盐、干旱和氧化等非生物胁迫的能力。为了进一步探究AtCYSa基因的功能以及在烟草中的应用，构建了植物表达载体pCAMBIA 1302-AtCYSa。通过PCR以及RT-PCR验证共获得4株阳性转基因烟草，选择其中3株转基因烟草进行盐胁迫处理和抗虫活性实验。在盐胁迫处理中，100mM NaCl和200mM NaCl处理组的丙二醛含量显著低于野生型对照组。伊文思蓝染色和细胞相对活性结果表明，转基因烟草的细胞活性比野生型烟草明显偏高。这说明在盐胁迫处理下，AtCYSa基因的表达能够起到保护转基因烟草的作用。抗虫活性研究发现，实验组的幼虫总重均呈明显的下降趋势，且幼虫死亡率显著高于对照组。这些结果表明，AtCYSa基因在烟草中的过量表达能够增强转基因烟草的耐盐以及抗虫的能力。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2018-01-11 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 为初步探讨Herpud1在肾脏发育中的生物学作用，过表达Herpud1载体及敲低Herpud1载体被构建。载体被转染进后肾间充质细胞，通过RT-PCR和蛋白免疫印迹检测了上皮间质的转换过程(EMT)的标志蛋白E-钙粘蛋白(E-cadherin)，波形蛋白(Vimentin)，Snail蛋白及内质网应力的标志蛋白葡萄糖调节蛋白78(GRP78），真核起始因子2α (eIF2α）的表达变化，通过EDU细胞增殖实验检测了Herpud1对细胞的增殖的作用，同时利用细胞划痕实验验证了细胞的迁移能力。结果显示，与空白对照组相比，在Herpud1过表达的实验组中，E-cadherin的表达在mRNA和蛋白水平均是降低的，而Snail和Vimentin的表达则是上升的，并伴随着细胞增殖活性的降低和细胞迁移能力增加，同时内质网应力相关蛋白GRP78和eIF2α是升高的。在Herpud1敲低的实验组，E-cadherin的表达在mRNA和蛋白水平均是升高的，而Snail和Vimentin的表达下降，细胞迁移能力是降低并且细胞增殖活性是升高的，同时内质网应力相关蛋白GRP78和eIF2α也是降低的。这些结果证明了Herpud1可以促进MK3细胞EMT过程，提高细胞的迁移能力，抑制细胞的增殖活性，其机制可能与细胞的内质网应力相关。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2018-01-04 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 猪链球菌是一种传染性革兰氏阳性细菌，是严重影响养猪业发展的重要人畜共患病原体，造成人类死亡率在5％到20％之间。其毒力因子在致病过程中发挥着重要作用。近年来对猪链球菌2型的毒力因子研究有诸多新的进展，对其致病机理的了解和对该病有效防控都有新的认识。本文对近些年研究2型猪链球菌毒力相关因子，在蛋白类、酶类研究新进展，同时对毒力因子基因表达双组份系统、与宿主免疫系统相互作用的IV型分泌系统的进展进行总结和分析，以期为猪链球菌病的治疗和疫苗的研制提供新参考。
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