分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2017-09-20
摘要： 琼脂糖微球是生化分离领域应用最广泛的分离介质基质，但尚存在微球粒径不均一、机械强度低以及原料的转化率低等问题，这导致生物大分子的分离纯化以及大规模层析生产效率低、工艺复杂化，成为了生化分离领域的发展瓶颈。常规搅拌等方法所制备的琼脂糖微球中琼脂糖含量大多小于6 wt%，当琼脂糖含量超过6 wt%时，水相粘度过大，传统的制备方法很难将高粘度的水相均匀地分散到油相中形成均一的乳液，导致生成的乳液粒径不均一。对于生化分离介质来说，小粒径介质能提供大比表面积，分辨率高；高琼脂糖含量不仅可以提高介质强度，还能丰富微球中的有效官能基团，为后续衍生应用提供基础。 本研究采用新型快速膜乳化技术，将琼脂糖加热溶解后，配制成所需浓度的琼脂糖溶液作为水相。将一定量的油溶性乳化剂溶于与水不相溶的有机相中并预热到一定温度下作油相。利用搅拌法将水相与油相混合制备得到W/O 型初乳液。利用快速膜乳化技术，通过调控压力，将初乳液迅速通过疏水修饰后SPG 膜得到粒径均一的W/O 型乳液，最后在缓慢搅拌的条件下冷却固化乳液胶凝，得到粒径均一的琼脂糖微球。 以6%琼脂糖浓度微球为例，在以石油醚及液体石蜡作为油相，与外水相体积比为1:6下，过膜压力0.3kgf/cm2的条件下，得到的微球平均粒径为30μm，Span值=0.62，CV 值=25%。对比市售Sepharose 6FF介质，粒径由90μm降到了30μm，而其CV 值提高了47%。而整个制球过程时间不超过10min，琼脂糖原料的成球转化率达到了100%。研究结果表明，当琼脂糖浓度分别达到8%、10%、12%、16%时，利用快速膜乳化法制备出的微球粒径可达28-32μm，Span值<0.9，CV 值<18%。 快速膜乳化制备的8%浓度琼脂糖微球经交联再通过烯丙基缩水甘油醚活化并偶联磺酸基制备成阳离子交换介质。上述介质用于纯化抗生素（万古霉素和螺旋霉素），粗品经柱上层析分离后，收集洗脱液，用HPLC分析纯品含量。研究结果表明，万古霉素纯度由88.7%提高至95.1%，螺旋霉素纯度提高至99.9%，纯度有了极大地提高。 快速膜乳化具有简单、高效等优点，在制备均一小粒径、高琼脂糖含量的分离介质方面具有突出优势。同时该方法也适用于其他载药纳微球的制备，有很好的应用前景。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2017-09-20
摘要： 层析技术在生物分离纯化领域占有非常重要的地位。作为该技术主要组成部分，层析介质的结构与性能极大地影响最终分离纯化效果。其中，载量是决定介质分离纯化能力的重要性质，如何提高介质载量是生物分离工程领域一直关注的重点。本论文以高载量琼脂糖层析介质为目标，分别开展了琼脂糖疏水层析介质和金属螯合层析介质的tailor-made研究。对于琼脂糖疏水层析介质，引入不同长度间臂，实现疏水性质可控制备，并用于CHO细胞表达乙肝表面抗原纯化，该方法能显著提高介质对疫苗的结合量，疫苗活性回收率达90%以上，纯化倍数65.8，均优于传统疏水介质。对于琼脂糖金属螯合介质，通过采取接枝葡聚糖策略，同时调控接枝程度，实现葡聚糖接枝可控制备。这种接枝型金属螯合介质对组氨酸标记重组蛋白的载量较传统介质提升1.5倍以上，远优于传统介质。Tailor-made型高载量层析介质在重组蛋白大规模分离纯化领域前景广阔。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2017-09-20
摘要： 维生素K2是一种人体必需维生素，具有促进凝血酶原产生和骨钙素合成等作用，在损伤细胞修复方面也有明显效果。微生物发酵法制备维生素K2具有环境影响小、生物活性高、生产成本低等优点，是维生素K2规模化制备的发展趋势。利用超声波和表面活性剂提高微生物发酵过程中菌体细胞通透性是一种常见的细胞代谢人工调控方法。低功率超声波的空化作用可以在细胞表面瞬间造成微伤，使细胞膜局部破裂从而改变细胞膜的通透性，有利于胞内物质释放或胞外物质进入细胞内。表面活性剂有助于提高营养物质溶解性，降低培养基表面张力，减小菌体表面和培养基的界面阻力，从而促进营养物质和菌体代谢产物的跨膜传输。 本文对实验室保藏的一株产维生素K2黄杆菌（Flavobacterium.sp）Fla-M进行低功率超声波辐照和表面活性剂处理，考察二者在提高细胞渗漏发酵方面的协同作用。首先在500 mL摇瓶中对Fla-M进行表面活性剂（聚氧乙烯油醚POE）添加时间和添加浓度优化，发现在发酵起始阶段添加1%POE效果最佳，发酵结束时生物量为13.4 g/L，胞外维生素K2产量为36.3 mg/L，相比于未添加POE的对照组（生物量7.32 g/L，胞外维生素K2 0.85 mg/L）分别提高了83.5%和41倍，扫描电镜观察发现在添加POE发酵的菌体表面聚集了大量表面活性剂胶团，由于POE与细胞膜磷脂分子结构相似，二者可能相溶形成混合胶束改变了细胞膜结构，进而改善细胞膜的通透性。其次在500 mL摇瓶中对Fla-M进行了超声方式、超声时机、超声功率以及作用时间研究，发现在菌体生长稳定期（发酵第5 d）、120 W 20 KHz条件下，插入式超声98 S（每次3 S，间隔4 S）效果最佳，发酵结束时生物量为11.1 g/L，胞外维生素K2达到50.1 mg/L, 相比于未超声对照组（生物量7.32 g/L，胞外维生素K2 0.85 mg/L），分别提高了51.6%和58倍。透射电镜观察发现超声波处理后尽管细胞膜完整但磷脂双分子层界限模糊，且细胞膜表面有孔状破损结构，可见疑似内容物外渗现象。在上述最优条件下，在500 mL摇瓶中综合运用POE和超声的处理方法，生物量和胞外维生素K2产量在发酵6 d后达到最大值，分别为生物量11.5 g/L，胞外维生素K2 59.7 mg/L，较单独运用POE或超声的方法发酵周期缩短3 d、胞外维生素K2产量分别提高64.4%和19.1%。运用排斥性染料碘化丙啶(PI)对发酵后细胞进行流式细胞仪检测，设001号为阴性对照，即未加荧光载体的未处理菌体的荧光信号；002号为处理的菌体加荧光载体的荧光信号；003号为未处理菌体加荧光载体的荧光信号；004号为阳性对照，即死细胞加荧光载体的荧光信号，阴性对照的001号菌体自发荧光区域以外的面积M1占总面积的比例预设为0，结果显示004号的M1占总面积的比例17.21%>002号M1占总面积的比例8.89%>003号M1占总面积的比例1.21%，说明死菌体的细胞膜通透性>渗漏培养菌体的细胞膜通透性>无渗漏培养菌体的细胞膜通透性，验证了经超声和表面活性剂处理后，菌体细胞膜通透性大幅提高。本研究对发酵法制备维生素K2的产业化开发具有一定的借鉴意义。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2017-09-20
摘要： 甘草酸（Glycyrrhizin，GL）是甘草最主要的有效成分之一，具有抗肿瘤、抗病毒、抗过敏、抗炎、及促进肾上腺皮激素等功能，在食品添加剂和化妆品领域也有广泛的应用，是一种重要的精细化工产品1,2。其分子中含有两个葡萄糖醛酸基使得其极性较强，导致其难以有效透过细胞膜并进一步在细胞内发挥药理作用，故甘草酸并非是其发挥最佳药理作用的最佳分子形态3,4。甘草酸的衍生物如单葡萄糖醛酸基甘草次酸（Glycyrrhetinic acid monoglucuronide，GAMG）和甘草次酸（Glycyrrhetinic acid，GA）分别为甘草酸经水解外侧的一个、两个葡萄糖醛酸基团的β-1,2糖苷键得到的产物。其中GAMG比GA缺少一个葡萄糖醛酸基团，极性中等，使得其在体内的溶解能力以及跨膜转运的能力得到很大提高，因此GAMG比GL和GA具有更高效的吸收率和利用度5。 课题组前期筛选出一种新型、特异性转化甘草酸生产单葡萄糖醛酸基甘草次酸的嗜松篮状菌（Talaromycespinophilum）的β-葡萄糖醛酸苷酶（TpGUS）。基于TpGUS广泛的商用和医用价值，以及课题组前期的一系列研究工作，本课题将以有优异分泌性能的枯草芽孢杆菌为对象，通过建立启动子和信号肽文库，并通过酶的定向进化，实现对酶基因的随机诱变，以期提高和改善酶的性能性质，为其投入工业化生产提供理论依据。最后通过酶学性质的表征，优化酶分子的酶学反应活性。 通过一系列的基因分子操作，以期能大规模的生产TpGUS，避免TpGUS在发酵过程中存在的在酿酒酵母中产率低、发酵周期长和生产成本高的瓶颈问题，对其未来的工业化应用有很重要的意义。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2017-09-20
摘要： 从河南省南阳地区土壤中分离的10株野生酵母菌株中，筛选到一株能够同步利用葡萄糖和木糖发酵高产油脂的酵母菌株ZZ-46。摇瓶发酵120 h，在葡萄糖：木糖为2:1条件下，生物量、油脂产量、油脂含量、油脂系数和产油速率分别达到20.23g/L、9.89 g/L、48.91%、14.64g/100g和0.083 g•L-1•h-1；该菌株利用5种不同比例混合糖（葡萄糖和木糖）产油脂的脂肪酸组成均以C16和C18系脂肪酸为主，其中油酸含量最高，其次为亚油酸、棕榈酸和硬脂酸，四种脂肪酸含量占总脂肪酸含量的90%以上，与植物油脂脂肪酸组成相似，可以作为生物柴油油源。通过形态特征及26S rDNA D1/D2区域序列分析，初步鉴定菌株ZZ-46为Cutaneotrichosporon dermatis，与Trichosporon dermatis同物异名。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2017-09-20
摘要： 2005 ~ 2017年间，世界塑料年产量从2.3亿吨增长到了4.0亿吨，预计到2050年，世界塑料年产量将达到34亿吨[1]。塑料消费产生的大量塑料废物，只有9%被回收利用，12% 被焚烧，79%被填埋或直接丢弃到环境中[2]。由于稳定的材料特性，塑料废物在自然条件下降解十分缓慢，预计到2050年，垃圾填埋场和自然环境中的塑料垃圾将达到120亿吨[2]。塑料垃圾在环境中的长期大量积累，给生态环境带来的严重污染和威胁，也成为一个全球性环境问题[3]。 随着一些塑料降解微生物或酶的发现，利用微生物或酶对塑料的降解作用，发展塑料污染的环境修复生物技术，已逐渐被意识到是一种解决塑料废物的新途径[4-6]。但是要实现塑料污染的高效生物降解和环境修复，有两大关键问题需要解决：1）塑料降解微生物或酶的来源。自19世纪40年代，塑料开始被人工合成并逐渐应用到生产生活之中，其出现历史不足80年。这么短的时间，被认为还不足以自然进化出广泛的塑料降解微生物或酶。探索自然界来源的塑料降解微生物和酶系统并加以利用，是开发塑料污染环境生物修复技术的重要基础性研究工作。2）塑料生物降解的速率。高分子长链的惰性化学结构单元、高分子链的大分子量和高分子链的聚集态结构等特征是阻碍影响微生物或酶降解塑料效率的重要因素。 针对这两个问题，作者开展了生物工程和高分子物理的交叉研究，取得了一些进展。1）揭示了昆虫及其肠道微生物是塑料分解微生物重要来源。从粮食害虫啮食塑料包装袋的自然现象受到启发，采用同位素示踪及多种物理化学分析技术，首次系统证实了黄粉虫能将PS长链分子解聚并分解为CO2；阐明了肠道微生物种群在塑料降解过程中起决定性作用。从黄粉虫和蜡虫肠道中分离出了降解聚苯乙烯（PS）、聚乙烯（PE）、聚氨酯（PUR）和聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）的细菌[4-5]。2）发现结晶高分子（如PE、PP和PET）的结晶度是影响生物分解速率的关键。微生物或酶在分解结晶高分子的过程中，优先分解高分子的无定形区，而对于结晶区分解十分缓慢，甚至不能分解[6]。结晶区的分子的堆砌形成的致密结构阻碍了酶残基对分子链的捕获。从高分子结晶热力学原理出发，提出一种不改变分子结构的基础上，实现结晶高分子向无定形的转变的去结晶化的方法，将结晶高分子的生物分解速率提高了100倍[7]。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2017-09-20
摘要： 维生素K2（VK2）是一系列具有异戊二烯侧链的甲萘醌类化合物，根据侧链长短不同，以MK-n表示。高活性VK2主要由微生物合成，具有防治骨质疏松症、出血症、肝硬化及帕金森症等疾病的生理功能。黄杆菌是其重要生产菌株，可合成包括MK4，MK5和MK6多种VK2同系物。 我们发现通过调控发酵温度，可以控制黄杆菌合成VK2的同系物类型和产量。在20~37℃范围内，25℃时Flavobacterium sp. M1-14生长最好，生物量达到8.8 g/L，但发酵产物完全是MK6，产量为13.9 mg/L，单位菌体产量1.6 mg/g。当发酵温度高于30℃，黄杆菌可同时合成MK4、MK5和MK6。37℃时，MK4和MK5产量最高，分别为1.6mg/L和1.7mg/L，VK2总量12.5 mg/L，但此时生物量仅5.5g/L，单位菌体产量为2.3mg/g。针对黄杆菌菌体生长和VK2同系物合成的最适温度差异，考虑采用变温发酵提高生物量和VK2产量。经多因素优化后，我们开发出先低温后高温的两段式变温策略，即25℃先发酵48小时，之后转为37℃继续发酵96小时，VK2产量达到20.9 mg/L（其中MK4为2.1 mg/L，MK5为2.3 mg/L、MK6为16.5mg/L），生物量为8.8g/L，单位菌体产量2.4mg/g。 继而，在30L发酵罐上，我们通过控制通气量和转速，考察了不同温度发酵对氧需求情况。发现在25℃和37℃时，黄杆菌发酵合成VK2的最佳kLa分别为360 h-1和60 h-1。针对变温发酵过程中菌体对氧需求的变化，我们开发了两阶段变kLa控制策略。优化后在变温发酵前期24小时kLa为360 h-1，之后120小时kLa 为60 h-1，VK2产量达到28.7 mg/L，（其中MK4为2.8mg/L，MK5为3.4 mg/L、MK6为22.5 mg/L），较起始提高了107%，生物量为15.5 g/L，单位菌体产量1.9 mg/g。 通过变温变kLa分阶段发酵调控策略，可以改变黄杆菌合成VK2的同系物类型，明显提高VK2产量，为实现VK2生物制备的工业化奠定了优化的基础。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2017-09-20
摘要： 毕赤酵母作为常用的蛋白表达系统，广泛应用于实验室规模的蛋白质制备、表征以及结构解析等方面，已有上千种蛋白在毕赤酵母系统中成功地得到表达。在工业酶制剂领域，也有许多酶制剂包括植酸酶、脂肪酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶等利用毕赤酵母实现了产业化规模的生产[1]。 酵母细胞壁在保护细胞完整性方面起到非常重要的作用，能够维持细胞渗透压平衡，在形态发生过程中产生并维持细胞的形态，并且在环境压力中有保护细胞的作用[2]。细胞壁主要由多糖和蛋白组成，其中多糖为β-1,3-葡聚糖，β-1,6-葡聚糖和几丁质，蛋白主要由N-和O-修饰的蛋白组成，在电子显微镜下观察发现，酵母的细胞壁厚约 200nm，分为电子密度不同的两层结构，外层甘露糖蛋白层和内层葡聚糖骨架[3]。GPI修饰的蛋白是一种通过糖脂共价连接在蛋白C端，从而将蛋白定位在细胞表面的一类蛋白。GPI修饰的蛋白在所有的真核细胞中都存在，并且其基本结构在大部分生物中都是保守的。通过对毕赤酵母全基因组中所有编码的蛋白序列进行分析，结合GPI型细胞壁蛋白的结构特征，最终在毕赤酵母GS115中发现50个潜在的GPI型细胞壁蛋白[4]，对这些蛋白的生化分析及功能鉴定需要进一步的探索。 通过对毕赤酵母GS115潜在的50个GPI细胞壁蛋白逐一进行单基因敲除，构建了GPI型细胞壁蛋白缺陷菌株库，研究了各细胞壁缺陷菌株在不同浓度碳源条件下的生长情况及细胞形态变化，以及细胞表面亲疏水变化及对细胞壁干扰剂的耐受性情况。研究发现敲除细胞壁蛋白会引起细胞多方面的变化，如对不同碳源的利用差异，对不同细胞壁干扰剂的耐受差异等。挑取一株甲醇耐受的菌株进行转录组学的分析，发现敲除后细胞代谢路径发生了明显变化，如细胞壁各组分的合成路径，细胞膜甾醇合成路径相关基因明显上调，同时一些胁迫路径也被激活，以抵抗高浓度甲醇对细胞的损害。通过对细胞壁蛋白功能进行深入的研究，将为毕赤酵母作为宿主菌表达外源蛋白提供重要的参考价值。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2017-09-20
摘要： 微生物燃料电池（Microbial Fuel Cells, 简称MFCs）是一种利用产电微生物作为催化剂，将有机物（无机物）中的化学能直接转化为电能的生物反应器，在生物产能和处理废水方面具有广阔的应用前景。 课题组以天津泰达污水处理厂的污泥为接种物，启动并运行MFCs。从阳极富集的生物膜上分离得到了多个分离株。其中，分离株P2-A-1和P2-A-5表现出较高的电化学活性，经鉴定后分别归属于Tolumonas osonensis 和Kocuria rhizophila，这是该种属微生物产电性能的首次报道。除了产电条件的优化，细胞的通透化处理是提高MFCs输出功率的有效手段，化学剂处理增加了菌体对电极的粘附效率，降低了MFCs内阻，增大了细胞通透性和细胞膜流动性，增加了关键电子载体CoQ10含量。通过构建膜包裹型MFCs、阳极液的循环伏安扫描及GC-MS成分分析，明确菌株的胞外电子传递机制。以模式产电微生物铜绿假单胞菌为对象，利用全局转录机制工程将系列内源和外源全局转录因子导入铜绿假单胞菌，利用代谢工程的思路，强化胞内电子的产生和胞外电子的传递，探讨高产电活性工程菌株的构建新策略和新方法。其中，外源全局转录因子IrrE的导入能显著提高铜绿假单胞菌的产电性能和环境压力耐受性。进一步分析发现，该转录因子的导入对中心代谢途径相关基因、生物膜相关基因、中介体合成相关基因、群体感应系统以及一般胁迫响应相关基因等的表达水平产生明显的影响。说明IrrE在宿主生物中发挥着全局调控作用。课题成果对于丰富产电微生物的多样性，提高微生物燃料电池的输出功率具有重要的意义。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2017-09-20
摘要： 蛋白质过量表达的调控研究中，关于基因转录、蛋白质修饰、折叠和分泌途径的分子机理研究及其在蛋白合成调控中的应用已经较为广泛。由于核糖体结构存在复杂性，关于蛋白质过量表达在核糖体翻译水平的研究及调控的报道较少。 毕赤酵母作为蛋白质表达和生产的重要工业菌株，已成为蛋白质高效表达调控研究的重要对象。在过去的研究中通过选择高效启动子提高蛋白质基因转录水平，过量表达内源UPR相关因子提高蛋白质折叠水平，优化分泌信号肽均能达到提高蛋白质合成与表达量的目的。前期研究在蛋白质过量表达的毕赤酵母细胞中发现了大量核糖体蛋白表达下调及细胞生长下降的现象，对核糖体蛋白及核糖体结构功能进行深入分析，有望从翻译水平上研究核糖体蛋白对细胞蛋白质过量表达的分子调控机理。 本课题使用iTRAQ LC-MS/MS技术分析重组毕赤核糖体蛋白及能量代谢途径的差异表达，发现在过表达木聚糖酶过程中有30个核糖体蛋白出现下调。对表达下调的核糖体蛋白进行基因缺失构建毕赤酵母突变菌株，通过Cre/loxp筛选标记可重复利用基因敲除系统在毕赤酵母GS115宿主中进行核糖体蛋白突变菌株的筛选及功能研究，成功获得了RPL22∆、RPL24∆、RPL26∆等28个核糖体蛋白突变菌株。分别以增强型绿色荧光蛋白egfp及植酸酶phy作为报告蛋白，初步分析突变株的细胞生长特性与蛋白质合成效率，并测定分析了其多聚核糖体图谱，结果表明缺失核糖体蛋白对细胞生长与蛋白质过量表达有不同程度的影响，且可使细胞翻译活性大幅下降。结合翻译组学和蛋白质新生肽链折叠稳定性分析，研究结果表明非必需核糖体蛋白缺失影响核糖体对蛋白质的翻译起始速率与延伸速率,进而影响蛋白质共翻译折叠效率，从蛋白质的合成质量上调控其产量，为进一步分析核糖体蛋白对翻译、内质网胁迫耐受及蛋白合成分泌等功能的影响和深入探讨核糖体蛋白对重组毕赤酵母细胞生长及蛋白质过量表达的分子调控机制提供基础。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2017-09-20
摘要： 熊胆粉作为保健食品和药品已经被使用了近千年。熊脱氧胆酸(Ursodeoxycholic acid, UDCA)是熊胆粉(需求量约为45吨/年)的主要活性成分，广泛用于脂肪性肝病、药物性肝炎、病毒性肝炎等胆汁淤积性肝病。7β-羟基甾醇脱氢酶(7β-HSDH, hydroxysteroid dehydrogenase)是双酶偶联法(图1)催化鹅脱氧胆酸(Chenodeoxycholic acid, CDCA)转化合成熊脱氧胆酸的关键瓶颈酶，其活性、稳定性以及辅酶亲和力均显著影响酶促生物转化路线的技术经济性。我们通过基因挖掘手段获得一个新酶7β-HSDHRt。然而, 迄今报道的所有7β-羟基甾醇脱氢酶大多具有活性低、稳定性差以及工作pH与7-HSDH不相容等共同缺陷, 从而导致目标产物UDCA的时空产率十分有限[1]。因此，采用酶工程技术大幅度提高相关酶的催化性能是决定生物技术能否拯救黑熊的关键所在。在此报告中我们提出了一种多目标共进化策略(MODE, multiobjective directed evolution)，用于改造7β-羟基甾醇脱氢酶的催化活性、热稳定性和最适pH值[2]。通过易错PCR、DNA shuffling和定点突变等方法，最终所得突变体V3−1的比活力比野生酶高 5.5倍，而半衰期延长3倍。此外，突变体的最适pH向弱碱性移动(pH 6.5pH 7.5)，从而更接近于前置酶7-HSDH所催化脱氢反应的酸碱度(pH 8.0)。使用上述共进化的突变酶V3−1进行级联转化反应时，UDCA 的时空产率达到 942 g L−1 d−1, 显著高于天然酶的 141 g L−1 d−1。由此可见，酶催化剂的蛋白质工程改造技术在提高酶的催化合成潜能，促进生物催化工艺在绿色化工制药领域的应用，以及在服务生态文明建设、推动环境保护和生态平衡等方面，均将发挥强大的威力。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2017-09-20
摘要： 巴斯德毕赤酵母（Pichiapastoris）是近年来发展迅速的一种高效表达的宿主菌。毕赤酵母属甲醇营养型酵母，具有操作简便、易于高密度培养、生长迅速、对翻译后的蛋白进行加工、生产成本低等优点。毕赤酵母表达系统已有20多年的研究开发使用历史，有多种表达载体和改良的宿主菌可供选择，可进行胞内表达或分泌表达。利用基于同源重组的DNA转化系统将基因整合进基因组是目前最重要的基因编辑手段之一，已经被广泛应用于毕赤酵母中；但毕赤酵母面临着筛选标记不足的难题。 在Cre/loxP系统中，当两个loxP位点以顺时针相同的方向放在一段序列之间时，Cre酶能识别并切除该序列，留下一个loxP位点。当使用突变的loxP序列（例如lox71和lox66），当被Cre重组酶识别并进行作用后，会留下一个新的突变的lox72位点，并不会与下次引入的loxP位点进行作用，从而避免了残留的loxP位点与新引入的loxP位点被Cre重组酶识别的可能。 本文通过在毕赤酵母通用质粒pPICZA和pGAPZA的基础上，在博来霉素抗性基因表达盒后融合了诱导表达Cre的表达盒，并在这两个表达盒前后引入了lox71和lox66位点，分别构建了质粒pZACH和pGACH；进而进行筛选标记循坏利用。具体过程如下：1、质粒转化毕赤酵母，使用博来霉素进行抗性筛选得到阳性转化子；2、将阳性转化子接种于含有诱导剂甲醇的YPM培养基中，培养过夜；3、将培养过夜的含菌体的培养基划线于不含抗生素的YPD平板上，培养至酵母单菌落可见；4、将3中的酵母单菌落同时点种于不含抗生素的YPD平板和含博来霉素的YPDZ平板上，如能在YPD平板上生长而不能在YPDZ平板上生长，则说明该菌落的博来霉素抗性表达盒已丢失，再使用PCR鉴定进行验证。整个抗性素标记丢失需要约4-5天。 使用质粒pZACH分别在毕赤酵母中表达了来源于柠檬酸杆菌（Citrobacteramalonaticus）CGMCC 1696的植酸酶和来源于抗辐射不动杆菌（Acinetobacterradioresistens） CMC-1的脂肪酶，这些质粒的抗性素标记丢失效率均大于70%，而且植酸酶和脂肪酶的产量与菌体生长都和使用基础质粒pPICZA进行表达的结果相似。该质粒对外源蛋白表达以及菌体生长并无不良影响。 使用筛选标记循坏利用质粒pZACH和pGACH，可以克服毕赤酵母中筛选标记不足的缺点，便于更好地在毕赤酵母中进行基因改造，从而为毕赤酵母的进一步工业应用提供基础。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2017-09-20
摘要： 酶的热稳定性差是限制其实际应用的最重要原因之一，因此，酶分子的热稳定性改造对扩大其工程应用具有重要的理论和实践意义1。最近，通过半理性和理性设计的分子改造而提高酶分子的热稳定因其工作量少、效率高而受到了学者的广泛关注。总体的思路是将目标酶分子中不稳定的氨基酸替换为稳定性氨基酸，从而提高酶结构的稳定性，因此，选择合适的突变位点是重点，这个通常是基于对酶分子结构和功能关系深刻认识的基础上实现的。目前，文献中报道的常用方法包括同源序列比对2、B-factor分析3以及柔性较高的loop改造4等。但是，如何准确、高效的确定潜在突变位点仍然是一个难题。本报告以课题组前期筛选到的来源真菌的β-葡萄糖醛酸苷酶（PGUS）为研究对象，在前期对E. coli重组表达β-葡萄糖醛酸苷酶（PGUS-E）的晶体结构解析的基础上，通过同源序列比对确定了影响PGUS-E稳定性的催化结构域的关键氨基酸位点，并通过定点突变显著的提高了其热稳定性。共获得三个突变体F292L/T293K, S35P和R304L，其动力学稳定性及热力学稳定性较野生型均有显著的提高，其中突变体F292L/T293K在65 oC下的半衰期提高了5倍，Tm值提高了3.2oC, 催化效率为野生型的6.4倍。最后，通过分子动力学模拟阐明了热稳定性提高的分子机制，结果表明三个突变体热稳定性的提高是由于C-末端固定化效应、脯氨酸效应以及疏水作用5。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2017-09-20
摘要： The current crisis of global warming is primarily attributed to CO2 production from excessive use of fossil fuels during recent decades, and has increased demand for renewable biofuels tremendously. Lipids are drawing considerable attention in relation to the production potential of biodiesel on the basis of their nontoxic, sustainable, and energy efficient proprieties. However, the high cost of microbial lipid produced by oleaginous microorganisms mainly stems from the high cost of glucose, which is estimated to be about 80% of the total medium cost. Therefore, considerable efforts have been directed toward minimizing the carbon source cost and finding new alternative carbon sources. In this report, several low-cost biomass including food-waste-derived volatile fatty acids, lignocellulose-based sugars, and methane derived from biogas were investigated for lipid production. After developing the culture modes and optimizing the culture conditions, both high lipid titer and productivity were achieved in high cell density cultures of different microorganisms using various carbon sources.
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2017-09-20
摘要： 镉作为非必需金属对人体健康造成很大威胁，有研究表明镉的积累会导致β淀粉样蛋白的增加[1]以及路易氏小体的形成[2]，从而引起阿尔兹海默症和帕金森症等神经退行性疾病的发生。从致病机理分析，镉通过破坏细胞内的Ca2+，NO，ROS，MAP kinase等信号通路的稳态从而导致细胞死亡[3]。目前针对MAPK的研究主要集中在MAPKs本身及其上游组分在镉胁迫下的应答方面，MAPKs的激活对下游效应蛋白的调控机制及效应蛋白种类的研究较少。 实验室前期工作发现，酵母细胞中的有丝分裂原蛋白激酶信号通路的三个核心组份（HOG1, SLT2和KSS1）基因缺失后对镉胁迫表现出了敏感性[4]，并对其中的两条途径——细胞壁完整性途径(Cell Wall Integrity, CWI)和渗透压甘油途径(High Osmolarity Glycerol, HOG)进行深入研究。本次研究以酿酒酵母野生型菌株BY4741及其背景下的HOG1和SLT2基因缺失株为研究对象，利用HiSeq2500检测50μM CdCl2胁迫下各基因表达量，选用DESeq差异表达分析软件进行样品组间的差异表达分析，并从中筛选出参与镉胁迫应答并与Hog1p和Slt2p调控相关的基因进行功能分析。随机挑选10个差异表达基因进行RT-qPCR对RNA-seq结果进行验证。 根据RNA-Seq数据，我们将差异表达基因筛选标准设定为FC>1.5，FDR<0.05，利用 GO、COG 和 KEGG 数据库对差异表达基因进行功能注释分析。结果表明，镉胁迫下hog1Δ与 BY4741相比，共有差异表达基因103个，GO注释功能主要集中在抗氧化、分子转运、新陈代谢、信号转导和应激应答等方面，与KEGG分析结果揭示出的两个主要响应途径——MAPK转导途径以及氨基酸合成代谢途径等结果相符，COG分析结果则进一步证明差异表达基因功能集中在新陈代谢及转运等过程；通过对差异表达基因的韦恩图分析得到26个受Hog1p正调控的基因，可能参与了Cd2+的运输；而TEC1、SFG1等5个基因被Hog1p负调控。镉胁迫下slt2Δ与 BY4741 菌株相比后差异表达基因有9个，三个数据库分析均证明功能集中在细胞周期调控及蛋白的合成加工方面。目前从两组缺失株调控的基因数据库中挑选出8个与离子运输、抗氧化胁迫功能相关的基因，包括NCW2、PRM5、YCT1等，分别构建了双基因缺失菌株并对其进行倍比稀释表型分析，已证明hog1yct1可以部分恢复HOG1缺失导致的镉敏感型表型，从表型结果推测YCT1位于MAPKs-Hog1p下游，相应镉原子吸收实验也证明该结论。YCT1为半胱氨酸的高亲和性转运蛋白[5]，尚无与Hog1p相关联的证据，二者互作的遗传学和理化试验的验证工作正在进行中。
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