分类： 生物学 >> 病毒学 提交时间： 2020-02-14
摘要： 摘要：2019年12月，中国武汉报道了2019新型冠状病毒（2019 novel Coronavirus，2019-nCoV）引起的肺炎。基于基因组信息，我们前期研究结果显示2019-nCoV与SARS冠状病毒虽然同属于Beta冠状病毒B亚群（BB冠状病毒），但两种病毒差异很大，这一结果与两者临床症状差异一致。前期研究还发现了BB冠状病毒存在大量的可变翻译，并从分子水平揭示了BB冠状病毒变异快、多样性高的特点。本研究在国际上首次报道BB冠状病毒S蛋白上的一个重要突变，这个突变使2019-nCoV具有了一个可供Furin蛋白酶切的位点，是除鼠肝炎冠状病毒外所有的其它BB冠状病毒（包括SARS和SARS样（SARS-like）冠状病毒）所不具有的。这个突变有可能增强了2019-nCoV侵染细胞的效率，进而使其传播力显著大于SARS冠状病毒。由于这个突变，2019冠状病毒的包装机制也会不同于SARS等其它大部分Beta冠状病毒，而有可能与鼠肝炎冠状病毒、HIV、埃博拉病毒和一些禽流感病毒的包装机制相同。作为一个意外发现，一些禽流感病毒也可以通过突变获得Furin蛋白酶切位点。对这个重要突变的后续研究将为揭示2019-nCoV传播力强的原因，以及为药物、抗体和疫苗的开发等工作奠定基础。
分类： 生物学 >> 生物物理学 >> 肿瘤学 提交时间： 2016-05-11
Wang, Anxin
Chen, Lisha
Li, Chunlin
Zhu, Yimin
Wang, Anxin
Chen, Lisha
Li, Chunlin
Wang, Anxin
Chen, Lisha
Li, Chunlin
摘要： Accumulating evidence suggests that cancer stem cells (CSCs) are heterogeneous populations and their phenotypes are unstable. A number of intrinsic and extrinsic mechanisms contribute to CSC phenotypic variation. The existence of various CSC subpopulations which would lead to a rapid relapse after primary treatments might pose a problem for CSC targeted therapeutics. In order to develop more effective approaches to cancer therapeutics, more CSC-related surface markers or targeting molecules, as well as some novel targeting strategies should be explored. This review summarized the origin and performance of heterogeneity in CSCs and discussed their therapeutic implications. (c) 2014 Elsevier Ireland Ltd. All rights reserved.
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2019-03-05 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 目的：构建产fusaruside的毕赤酵母菌株，解决天然小分子免疫抑制剂fusaruside的来源问题。方法：从禾谷镰刀菌Fusarium graminearum PH-1中扩增获得合成fusaruside的相关基因—3位去饱和酶（Δ3(E)-SD）和10位去饱和酶（Δ10(E)-SD）基因；并通过2A肽策略构建两种基因的共表达载体，转化到毕赤酵母GS115中进行双酶的诱导表达；对诱导后的毕赤酵母菌体进行甲醇和二氯甲烷的处理后,经高效液相色谱质谱联用仪(HPLC-MS)检测其中产物变化。结果：3位去饱和酶和10位去饱和酶在毕赤酵母中成功共表达，SDS-PAGE显示3位去饱和酶分子量约为48 kDa，10位去饱和酶分子量约为65 kDa；HPLC-MS显示重组酵母可以产生fusaruside。结论：与fusaruside原产菌株镰刀菌相比，该酵母菌的发酵时间更短，产量更高，为fusaruside的进一步开发与应用奠定基础。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2019-04-21 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）KT2440中的6-羟基烟酸（6HNA）3-单加氧酶（NicC）是烟酸代谢过程中的关键酶。NicC通过在吡啶环上加羟基对吡啶环进行了活化，从而使得吡啶环可在双加氧酶催化下开环最终被完全降解。本研究通过去除NicC的N端稀有密码子增加了NicC的表达量，进一步利用Ni-Sepharose重力柱对NicC进行了纯化。通过实验发现，NicC的最适反应温度为30℃-40℃，最适反应pH为8.0。Cd2+离子对于NicC的酶活有明显的抑制作用。当NADH的浓度为0.25 mM的时候，底物6HNA所对应的NicC的最大酶活为14.1 U/mg，Km值为51.8 μM；当6HNA的浓度为0.25 mM的时候，底物NADH所对应的NicC的最大酶活为10.79 U/mg，Km值为15.0 μM。通过HPLC和LC-MS分析表明，NicC可以在NADH和氧气的参与下催化6HNA转化生成2,5-二羟基吡啶（2,5-DHP）和甲酸，另外可以将对羟基苯甲酸转化生成对苯二酚。同位素标记实验表明产物2,5-DHP中的氧原子来源于参与反应的氧气。该研究为研究吡啶类化合物微生物代谢提供了理论基础。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2019-03-05 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 目的：利用新型纳米森林材料，构建一种操作简单、检测快速、灵敏度高的用于现场检测的自驱动微流控芯片。方法：利用MEMS加工技术制备出具有优良光学性能和大表面积的石英纳米森林结构微流道，对该纳米森林结构的高度、宽度/横向尺寸、密度、表面积、光学性能、毛细驱动效果、荧光增敏效果做出评价,利用双抗体夹心的方法进行蓖麻毒素的检测。结果：纳米纤维锥底直径约200~300nm，高度约1.0um，纳米森林的密度约为10个/μm2，估测表面积比底面积达5:1以上。其在波长为680nm处的透光率达89.5%，驱动流速约5mm/s，与平面结构相比，其饱和荧光显色成倍提高。蓖麻毒素的检测限低于10 pg/ml，在 10~6250pg/ml范围内具有较好线性关系。结论：基于纳米森林结构，成功构建了一种具有超大表面积和高灵敏度的毛细自驱动微流控芯片。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2019-03-05 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 跨国种业企业第三次大规模的兼并重组形成了新一轮的国际种业竞争格局，而知识产权保护则是跨国种业公司兼并重组的最大动力之一。研究跨国种业公司并购形成的核心知识产权的积聚重组，更能深度考察国际种业竞争新格局的变化趋势。趋势之一，美日欧三国仍然是全球育种研发创新活动的主导者和垄断者，大规模的兼并重组，实现了技术和资源的整合，提升了国际种业集中度，全球种业42.75%的专利申请量集中在美国、日本和欧盟，并且掌握着全球64.68%的DNA重组技术专利。趋势之二，知识产权已经成为跨国种业公司保持市场竞争优势的有力武器，跨国种业公司是核心种业技术专利的拥有者，拜耳/孟山都、中国化工/先正达和杜邦先锋/陶氏的育种专利申请量占全球总育种专利申请量将近14%，全球农作物的转化体81%以上被跨国种业公司所掌握。对国际种业新格局的变化趋势进行研究分析，可以为我国种业兼并重组提供有价值的政策建议。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2019-03-05 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 【目的】 通过研究miR-17-5p对自噬相关基因ATG7的靶向调控机制和对细胞自噬的作用，探究miR-17-5p在结核分枝杆菌介导的自噬途径中的作用及其机制。【方法】 生物信息学分析得到miR17-5p的靶基因ATG7，通过成功构建载体ATG7野生型（pMirGLO-ATG7-3'UTR-WT）和突变型，利用双荧光素酶报告系统、Western blot验证miR-17-5p和ATG7的靶向关系，同时构建结核分枝杆菌（H37Ra）感染的人源性THP-1巨噬细胞模型，将做不同处理的细胞分为三组：miR-17-5p mimics，miR-17-5p inhibitor，miR-17-5p nc。通过实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）检测H37Ra感染对miR-17-5p表达量的影响，并且进一步通过Western blot、免疫荧光观察检测LC3蛋白的表达量和自噬小体的数量。【结果】 MTB感染能够引起miR-17-5p的下调，随着感染复数的增加有明显的降低。而生物信息学预测结果显示miR-17-5p与ATG7具有靶向性，双荧光素酶报告实验、Western blot验证miR-17-5p能够和ATG7靶向结合，并对其进行负调控。进一步通过Western blot，免疫荧光观察发现miR-17-5p mimics组LC3Ⅱ的表达下调，自噬小体表达降低，而miR-17-5p inhibitor组相反。其中对H37Ra感染组与未感染组之间比较，ATG7和LC3Ⅱ蛋白表达明显增强。【结论】 miR-17-5p直接靶向结合ATG7 3'UTR抑制自噬，在巨噬细胞抗MTB过程中发挥作用。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2019-02-13 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 摘要：木聚糖（Xylan）在自然界中的含量极其丰富，在农作物和农林剩余物中大量存在。随着能源资源问题的日益凸显，对木聚糖的应用和研究越来越受到重视。木聚糖酶（Xylanase）是可以将木聚糖降解为低聚木糖和木糖的一类水解酶，近年来，为了实现木聚糖酶的高产、高酶活表达，科研工作者做了大量的研究工作，本文将就木聚糖酶异源表达（Heterologous expression）的研究进展进行综述。 关键词：木聚糖；木聚糖酶；异源表达
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2017-09-20
摘要： 微生物燃料电池（Microbial Fuel Cells, 简称MFCs）是一种利用产电微生物作为催化剂，将有机物（无机物）中的化学能直接转化为电能的生物反应器，在生物产能和处理废水方面具有广阔的应用前景。 课题组以天津泰达污水处理厂的污泥为接种物，启动并运行MFCs。从阳极富集的生物膜上分离得到了多个分离株。其中，分离株P2-A-1和P2-A-5表现出较高的电化学活性，经鉴定后分别归属于Tolumonas osonensis 和Kocuria rhizophila，这是该种属微生物产电性能的首次报道。除了产电条件的优化，细胞的通透化处理是提高MFCs输出功率的有效手段，化学剂处理增加了菌体对电极的粘附效率，降低了MFCs内阻，增大了细胞通透性和细胞膜流动性，增加了关键电子载体CoQ10含量。通过构建膜包裹型MFCs、阳极液的循环伏安扫描及GC-MS成分分析，明确菌株的胞外电子传递机制。以模式产电微生物铜绿假单胞菌为对象，利用全局转录机制工程将系列内源和外源全局转录因子导入铜绿假单胞菌，利用代谢工程的思路，强化胞内电子的产生和胞外电子的传递，探讨高产电活性工程菌株的构建新策略和新方法。其中，外源全局转录因子IrrE的导入能显著提高铜绿假单胞菌的产电性能和环境压力耐受性。进一步分析发现，该转录因子的导入对中心代谢途径相关基因、生物膜相关基因、中介体合成相关基因、群体感应系统以及一般胁迫响应相关基因等的表达水平产生明显的影响。说明IrrE在宿主生物中发挥着全局调控作用。课题成果对于丰富产电微生物的多样性，提高微生物燃料电池的输出功率具有重要的意义。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2019-03-05 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 目的：建立OTUB1肝脏特异性基因敲除小鼠模型，初步分析其表型并研究OTUB1基因与肝脏代谢的关系。方法：利用Cre/Loxp系统构条件性基因敲除小鼠模型，即将OTUB1fl/fl转基因小鼠与Alb-Cre小鼠杂交,子代自交，得到OTUB1肝特异性基因敲除小鼠并进行鉴定。取同窝对照小鼠（control, NC）和肝特异型基因敲除（hepatic-specific OTUB1 knockout, HCKO）小鼠，通过PCR和免疫印迹（Western blot, WB），确证OTUB1肝脏特异性基因敲除小鼠模型是否成功构建。通过组织病理学方法，分析主要组织器官的形态以及是否存在自发的病变；通过血清生化指标检测肝脏脂代谢水平；通过血糖耐受实验（GTT）分析HCKO小鼠对血糖的控制。结果：基因组测序和WB检测结果显示HCKO小鼠肝脏中OTUB1被敲除，其他组织中OTUB1表达水平无变化，证明OTUB1肝脏特异性基因敲除小鼠模型构建成功。HCKO小鼠出生正常，各组织器官无异常，生化指标中总胆固醇水平明显降低，表明OTUB1影响肝脏脂代谢水平。糖耐受实验中HCKO小鼠血糖回落迅速，表明敲除OTUB1影响肝脏血糖调节稳态。结论：应用Cre/Loxp技术成功建立OTUB1肝脏特异性基因敲除小鼠模型,为研究OTUB1在肝脏的生理功能和调控机制提供了重要的动物模型。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2019-02-13 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 摘要：以毕赤酵母为异源表达宿主合成人胰岛素前体，在实验室研究和工业生产中已有广泛应用。目前研究主要使用天然甲醇诱导型AOX1启动子，以甲醇为单一基础碳源进行胰岛素前体的诱导发酵生产。但在毕赤酵母高密度发酵生产过程中，甲醇代谢过程耗氧大、产热高，补料控制工艺复杂，限制了发酵生产的放大。本研究基于我们前期对启动子AOX1的转录调控设计研究，提出以人工设计的高效组成型转录调控器件CSAD_5驱动胰岛素前体基因表达，开发了葡萄糖为碳源的发酵生产工艺，以解决甲醇体系中的产热、耗氧以及工艺控制问题。在此基础上，通过增强筛选压力提高异源基因拷贝，获得了一株胰岛素前体高表达重组毕赤酵母，利用优化的培养工艺在5 L反应器水平发酵生产，胰岛素前体产量在108 h达到1.85 g/L，为目前报道以葡萄糖为碳源，生产人胰岛素前体的最高水平。该研究为胰岛素前体的工业生产以及毕赤酵母的应用提供了新的思路和方法。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2019-01-17 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 外泌体是细胞内源性囊泡样生物纳米级膜结构，直径大小在40-100 nm之间，可由各种类型的细胞分泌释放。外泌体具有许多功能，如蛋白质、mRNA、miRNA和脂类的细胞间运输和传递，以及抗原递呈，还可能具有致癌的能力。肿瘤细胞所分泌释放的外泌体在肿瘤的发生、发展以及迁移等生理和病理过程中发挥重要的作用。目前从肿瘤外泌体中寻找特异性标志物已成为肿瘤研究者重点关注的方向，对肿瘤早期诊断、疗效评价和预后分析具有重要的意义。本文作者就近年来外泌体在肿瘤研究和诊断中研究进展进行综述。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2019-02-13 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 摘要：高分子囊泡作为一种新型的纳米药物载体，具有生物可降解性、稳定性、生物相容性以及可修饰的多功能化等特点。改变聚合物种类和亲水-疏水嵌段的比例，可以制备具有不同形态和膜特性的高分子囊泡。经过修饰后的高分子囊泡，可赋予其更多的功能，从而实现药物的控释和药物靶向的能力。本文对高分子囊泡的结构、组成和制备方法以及在药物释放体系的应用等方面进行了较为详细的综述，目的是了解高分子囊泡最新研究进展以及未来科学家们亟需要解决的重要问题。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2017-09-20
摘要： 维生素K2（VK2）是一系列具有异戊二烯侧链的甲萘醌类化合物，根据侧链长短不同，以MK-n表示。高活性VK2主要由微生物合成，具有防治骨质疏松症、出血症、肝硬化及帕金森症等疾病的生理功能。黄杆菌是其重要生产菌株，可合成包括MK4，MK5和MK6多种VK2同系物。 我们发现通过调控发酵温度，可以控制黄杆菌合成VK2的同系物类型和产量。在20~37℃范围内，25℃时Flavobacterium sp. M1-14生长最好，生物量达到8.8 g/L，但发酵产物完全是MK6，产量为13.9 mg/L，单位菌体产量1.6 mg/g。当发酵温度高于30℃，黄杆菌可同时合成MK4、MK5和MK6。37℃时，MK4和MK5产量最高，分别为1.6mg/L和1.7mg/L，VK2总量12.5 mg/L，但此时生物量仅5.5g/L，单位菌体产量为2.3mg/g。针对黄杆菌菌体生长和VK2同系物合成的最适温度差异，考虑采用变温发酵提高生物量和VK2产量。经多因素优化后，我们开发出先低温后高温的两段式变温策略，即25℃先发酵48小时，之后转为37℃继续发酵96小时，VK2产量达到20.9 mg/L（其中MK4为2.1 mg/L，MK5为2.3 mg/L、MK6为16.5mg/L），生物量为8.8g/L，单位菌体产量2.4mg/g。 继而，在30L发酵罐上，我们通过控制通气量和转速，考察了不同温度发酵对氧需求情况。发现在25℃和37℃时，黄杆菌发酵合成VK2的最佳kLa分别为360 h-1和60 h-1。针对变温发酵过程中菌体对氧需求的变化，我们开发了两阶段变kLa控制策略。优化后在变温发酵前期24小时kLa为360 h-1，之后120小时kLa 为60 h-1，VK2产量达到28.7 mg/L，（其中MK4为2.8mg/L，MK5为3.4 mg/L、MK6为22.5 mg/L），较起始提高了107%，生物量为15.5 g/L，单位菌体产量1.9 mg/g。 通过变温变kLa分阶段发酵调控策略，可以改变黄杆菌合成VK2的同系物类型，明显提高VK2产量，为实现VK2生物制备的工业化奠定了优化的基础。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2017-09-20
摘要： 层析技术在生物分离纯化领域占有非常重要的地位。作为该技术主要组成部分，层析介质的结构与性能极大地影响最终分离纯化效果。其中，载量是决定介质分离纯化能力的重要性质，如何提高介质载量是生物分离工程领域一直关注的重点。本论文以高载量琼脂糖层析介质为目标，分别开展了琼脂糖疏水层析介质和金属螯合层析介质的tailor-made研究。对于琼脂糖疏水层析介质，引入不同长度间臂，实现疏水性质可控制备，并用于CHO细胞表达乙肝表面抗原纯化，该方法能显著提高介质对疫苗的结合量，疫苗活性回收率达90%以上，纯化倍数65.8，均优于传统疏水介质。对于琼脂糖金属螯合介质，通过采取接枝葡聚糖策略，同时调控接枝程度，实现葡聚糖接枝可控制备。这种接枝型金属螯合介质对组氨酸标记重组蛋白的载量较传统介质提升1.5倍以上，远优于传统介质。Tailor-made型高载量层析介质在重组蛋白大规模分离纯化领域前景广阔。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2017-09-20
摘要： 琼脂糖微球是生化分离领域应用最广泛的分离介质基质，但尚存在微球粒径不均一、机械强度低以及原料的转化率低等问题，这导致生物大分子的分离纯化以及大规模层析生产效率低、工艺复杂化，成为了生化分离领域的发展瓶颈。常规搅拌等方法所制备的琼脂糖微球中琼脂糖含量大多小于6 wt%，当琼脂糖含量超过6 wt%时，水相粘度过大，传统的制备方法很难将高粘度的水相均匀地分散到油相中形成均一的乳液，导致生成的乳液粒径不均一。对于生化分离介质来说，小粒径介质能提供大比表面积，分辨率高；高琼脂糖含量不仅可以提高介质强度，还能丰富微球中的有效官能基团，为后续衍生应用提供基础。 本研究采用新型快速膜乳化技术，将琼脂糖加热溶解后，配制成所需浓度的琼脂糖溶液作为水相。将一定量的油溶性乳化剂溶于与水不相溶的有机相中并预热到一定温度下作油相。利用搅拌法将水相与油相混合制备得到W/O 型初乳液。利用快速膜乳化技术，通过调控压力，将初乳液迅速通过疏水修饰后SPG 膜得到粒径均一的W/O 型乳液，最后在缓慢搅拌的条件下冷却固化乳液胶凝，得到粒径均一的琼脂糖微球。 以6%琼脂糖浓度微球为例，在以石油醚及液体石蜡作为油相，与外水相体积比为1:6下，过膜压力0.3kgf/cm2的条件下，得到的微球平均粒径为30μm，Span值=0.62，CV 值=25%。对比市售Sepharose 6FF介质，粒径由90μm降到了30μm，而其CV 值提高了47%。而整个制球过程时间不超过10min，琼脂糖原料的成球转化率达到了100%。研究结果表明，当琼脂糖浓度分别达到8%、10%、12%、16%时，利用快速膜乳化法制备出的微球粒径可达28-32μm，Span值<0.9，CV 值<18%。 快速膜乳化制备的8%浓度琼脂糖微球经交联再通过烯丙基缩水甘油醚活化并偶联磺酸基制备成阳离子交换介质。上述介质用于纯化抗生素（万古霉素和螺旋霉素），粗品经柱上层析分离后，收集洗脱液，用HPLC分析纯品含量。研究结果表明，万古霉素纯度由88.7%提高至95.1%，螺旋霉素纯度提高至99.9%，纯度有了极大地提高。 快速膜乳化具有简单、高效等优点，在制备均一小粒径、高琼脂糖含量的分离介质方面具有突出优势。同时该方法也适用于其他载药纳微球的制备，有很好的应用前景。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2017-09-20
摘要： 巴斯德毕赤酵母（Pichiapastoris）是近年来发展迅速的一种高效表达的宿主菌。毕赤酵母属甲醇营养型酵母，具有操作简便、易于高密度培养、生长迅速、对翻译后的蛋白进行加工、生产成本低等优点。毕赤酵母表达系统已有20多年的研究开发使用历史，有多种表达载体和改良的宿主菌可供选择，可进行胞内表达或分泌表达。利用基于同源重组的DNA转化系统将基因整合进基因组是目前最重要的基因编辑手段之一，已经被广泛应用于毕赤酵母中；但毕赤酵母面临着筛选标记不足的难题。 在Cre/loxP系统中，当两个loxP位点以顺时针相同的方向放在一段序列之间时，Cre酶能识别并切除该序列，留下一个loxP位点。当使用突变的loxP序列（例如lox71和lox66），当被Cre重组酶识别并进行作用后，会留下一个新的突变的lox72位点，并不会与下次引入的loxP位点进行作用，从而避免了残留的loxP位点与新引入的loxP位点被Cre重组酶识别的可能。 本文通过在毕赤酵母通用质粒pPICZA和pGAPZA的基础上，在博来霉素抗性基因表达盒后融合了诱导表达Cre的表达盒，并在这两个表达盒前后引入了lox71和lox66位点，分别构建了质粒pZACH和pGACH；进而进行筛选标记循坏利用。具体过程如下：1、质粒转化毕赤酵母，使用博来霉素进行抗性筛选得到阳性转化子；2、将阳性转化子接种于含有诱导剂甲醇的YPM培养基中，培养过夜；3、将培养过夜的含菌体的培养基划线于不含抗生素的YPD平板上，培养至酵母单菌落可见；4、将3中的酵母单菌落同时点种于不含抗生素的YPD平板和含博来霉素的YPDZ平板上，如能在YPD平板上生长而不能在YPDZ平板上生长，则说明该菌落的博来霉素抗性表达盒已丢失，再使用PCR鉴定进行验证。整个抗性素标记丢失需要约4-5天。 使用质粒pZACH分别在毕赤酵母中表达了来源于柠檬酸杆菌（Citrobacteramalonaticus）CGMCC 1696的植酸酶和来源于抗辐射不动杆菌（Acinetobacterradioresistens） CMC-1的脂肪酶，这些质粒的抗性素标记丢失效率均大于70%，而且植酸酶和脂肪酶的产量与菌体生长都和使用基础质粒pPICZA进行表达的结果相似。该质粒对外源蛋白表达以及菌体生长并无不良影响。 使用筛选标记循坏利用质粒pZACH和pGACH，可以克服毕赤酵母中筛选标记不足的缺点，便于更好地在毕赤酵母中进行基因改造，从而为毕赤酵母的进一步工业应用提供基础。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2017-09-20
摘要： 毕赤酵母作为常用的蛋白表达系统，广泛应用于实验室规模的蛋白质制备、表征以及结构解析等方面，已有上千种蛋白在毕赤酵母系统中成功地得到表达。在工业酶制剂领域，也有许多酶制剂包括植酸酶、脂肪酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶等利用毕赤酵母实现了产业化规模的生产[1]。 酵母细胞壁在保护细胞完整性方面起到非常重要的作用，能够维持细胞渗透压平衡，在形态发生过程中产生并维持细胞的形态，并且在环境压力中有保护细胞的作用[2]。细胞壁主要由多糖和蛋白组成，其中多糖为β-1,3-葡聚糖，β-1,6-葡聚糖和几丁质，蛋白主要由N-和O-修饰的蛋白组成，在电子显微镜下观察发现，酵母的细胞壁厚约 200nm，分为电子密度不同的两层结构，外层甘露糖蛋白层和内层葡聚糖骨架[3]。GPI修饰的蛋白是一种通过糖脂共价连接在蛋白C端，从而将蛋白定位在细胞表面的一类蛋白。GPI修饰的蛋白在所有的真核细胞中都存在，并且其基本结构在大部分生物中都是保守的。通过对毕赤酵母全基因组中所有编码的蛋白序列进行分析，结合GPI型细胞壁蛋白的结构特征，最终在毕赤酵母GS115中发现50个潜在的GPI型细胞壁蛋白[4]，对这些蛋白的生化分析及功能鉴定需要进一步的探索。 通过对毕赤酵母GS115潜在的50个GPI细胞壁蛋白逐一进行单基因敲除，构建了GPI型细胞壁蛋白缺陷菌株库，研究了各细胞壁缺陷菌株在不同浓度碳源条件下的生长情况及细胞形态变化，以及细胞表面亲疏水变化及对细胞壁干扰剂的耐受性情况。研究发现敲除细胞壁蛋白会引起细胞多方面的变化，如对不同碳源的利用差异，对不同细胞壁干扰剂的耐受差异等。挑取一株甲醇耐受的菌株进行转录组学的分析，发现敲除后细胞代谢路径发生了明显变化，如细胞壁各组分的合成路径，细胞膜甾醇合成路径相关基因明显上调，同时一些胁迫路径也被激活，以抵抗高浓度甲醇对细胞的损害。通过对细胞壁蛋白功能进行深入的研究，将为毕赤酵母作为宿主菌表达外源蛋白提供重要的参考价值。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2017-09-20
摘要： 从河南省南阳地区土壤中分离的10株野生酵母菌株中，筛选到一株能够同步利用葡萄糖和木糖发酵高产油脂的酵母菌株ZZ-46。摇瓶发酵120 h，在葡萄糖：木糖为2:1条件下，生物量、油脂产量、油脂含量、油脂系数和产油速率分别达到20.23g/L、9.89 g/L、48.91%、14.64g/100g和0.083 g•L-1•h-1；该菌株利用5种不同比例混合糖（葡萄糖和木糖）产油脂的脂肪酸组成均以C16和C18系脂肪酸为主，其中油酸含量最高，其次为亚油酸、棕榈酸和硬脂酸，四种脂肪酸含量占总脂肪酸含量的90%以上，与植物油脂脂肪酸组成相似，可以作为生物柴油油源。通过形态特征及26S rDNA D1/D2区域序列分析，初步鉴定菌株ZZ-46为Cutaneotrichosporon dermatis，与Trichosporon dermatis同物异名。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2017-09-20
摘要： 熊胆粉作为保健食品和药品已经被使用了近千年。熊脱氧胆酸(Ursodeoxycholic acid, UDCA)是熊胆粉(需求量约为45吨/年)的主要活性成分，广泛用于脂肪性肝病、药物性肝炎、病毒性肝炎等胆汁淤积性肝病。7β-羟基甾醇脱氢酶(7β-HSDH, hydroxysteroid dehydrogenase)是双酶偶联法(图1)催化鹅脱氧胆酸(Chenodeoxycholic acid, CDCA)转化合成熊脱氧胆酸的关键瓶颈酶，其活性、稳定性以及辅酶亲和力均显著影响酶促生物转化路线的技术经济性。我们通过基因挖掘手段获得一个新酶7β-HSDHRt。然而, 迄今报道的所有7β-羟基甾醇脱氢酶大多具有活性低、稳定性差以及工作pH与7-HSDH不相容等共同缺陷, 从而导致目标产物UDCA的时空产率十分有限[1]。因此，采用酶工程技术大幅度提高相关酶的催化性能是决定生物技术能否拯救黑熊的关键所在。在此报告中我们提出了一种多目标共进化策略(MODE, multiobjective directed evolution)，用于改造7β-羟基甾醇脱氢酶的催化活性、热稳定性和最适pH值[2]。通过易错PCR、DNA shuffling和定点突变等方法，最终所得突变体V3−1的比活力比野生酶高 5.5倍，而半衰期延长3倍。此外，突变体的最适pH向弱碱性移动(pH 6.5pH 7.5)，从而更接近于前置酶7-HSDH所催化脱氢反应的酸碱度(pH 8.0)。使用上述共进化的突变酶V3−1进行级联转化反应时，UDCA 的时空产率达到 942 g L−1 d−1, 显著高于天然酶的 141 g L−1 d−1。由此可见，酶催化剂的蛋白质工程改造技术在提高酶的催化合成潜能，促进生物催化工艺在绿色化工制药领域的应用，以及在服务生态文明建设、推动环境保护和生态平衡等方面，均将发挥强大的威力。
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