应用合成生物学策略构建全细胞生物催化剂合成(S)-乙偶姻

分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2018-11-24 合作期刊: 《中国生物工程杂志》

李检秀 陈先锐 陈小玲 黄艳燕 莫棋文 谢能中 黄日波

摘要： 目的：在大肠杆菌宿主中过量表达丁二酮还原酶（DAR），同时构建辅酶NADH原位再生系统，利用全细胞高效催化丁二酮不对称还原合成(S)-乙偶姻。方法：PCR克隆多粘芽孢杆菌（Paenibacilluspolymyxa）dar基因，连到质粒pETDuet-1，转化至大肠杆菌（Escherichia coli）BL21(DE3)，构建重组菌E.coli BL21(DE3)-DAR；通过HiTrap TALON柱亲和层析纯化表达产物DAR酶蛋白，测定DAR的比酶活和分子动力学参数。在重组菌E.coli BL21(DE3)-DAR中构建辅酶NADH原位再生系统，协同表达枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的葡萄糖脱氢酶（GDH），构建重组菌E.coli BL21(DE3)-DAR/GDH，并以此重组菌为全细胞生物催化剂，优化催化条件，提高(S)-乙偶姻的产量和产率。结果：获得重组工程菌E.coli BL21(DE3)-DAR和E.coli BL21(DE3)-DAR/GDH。DAR以NADH为辅酶还原丁二酮的米氏常数Km、最大催化速率Vmax、催化常数Kcat分别为2.59 mM，1.64 μmol/L∙min∙mg，12.3 /s，还原丁二酮生成(S)-乙偶姻光学的纯度为95.86 %，具有较好的催化效率和立体异构体选择性。构建辅酶NADH原位再生系统后，重组菌E.coli BL21(DE3)-DAR/GDH可高效催化丁二酮合成乙偶姻。在最优催化条件下分批补料，乙偶姻产量达51.26 g/L，转化率81.37 %，生产速率5.13 g/(L∙h)。结论：使用非手性化合物原料丁二酮生产高附加值的手性化合物(S)-乙偶姻，以重组菌为全细胞生物催化剂合成(S)-乙偶姻，不需额外添加昂贵的辅酶，具有较高的生产应用价值。

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