分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2018-01-16 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： SUMO蛋白酶（Ulp1）是切割小分子泛素修饰（SUMO）融合蛋白获得天然N端靶蛋白的一种工具酶，具有酶切效率高，特异性好等优点。但现有市售SUMO蛋白酶Ulp1价格昂贵，操作复杂，限制了SUMO融合体系的运用。利用基因工程技术，合成基因ulp1（Leu403-Lys621），并在N端和C端加入多聚组氨酸标签（His6），构建重组表达载体psvT7-ulp1，将重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)和BL21 trxB(DE3)中。经过高通量筛选技术快速确定最优的表达条件为采用BL21(DE3)作为表达宿主，转接后7 h加入IPTG，IPTG的终浓度为0.1 mmol/L，诱导时间为16 h，最终蛋白表达量占菌体总蛋白的34.5%，重组蛋白Ulp1的表达量为190mg/L，通过Ni-NTA一步纯化即可得到纯度95%以上的Ulp1。通过酶切反应，测定酶活为5.19 U/μl，比酶活为5.23×104 U/mg，是先前报道比酶活的1.87倍，通过酶活动力学分析，Ulp1的表观米氏常数 Km=0.359 g/L，Vm=5.10μg/(mL·min)。将SUMO融合表达体系用于单链抗体（Single-Chain Antibody Fragment，scFv）的表达，得到可溶的SUMO-scFv融合蛋白，使用表达的Ulp1进行酶切并纯化，获得纯度高于90%且N端不含多余氨基酸的scFv,操作步骤简单，显著改善了scFv在大肠杆菌中难于高效可溶性表达纯化的现状。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2017-07-24 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 摘 要：【目的】分离确认巴斯德毕赤酵母中甘油转运体并初步研究其功能。 【方法】通过生物信息学方法从NCBI数据库中查找可能的甘油转运体(gt1, GeneID: 8197545)，并通过DAS软件对其跨膜结构域进行预测。通过PCR方法扩增该基因并将其与EGFP融合克隆到pPICZ B以及pRS424载体进行亚细胞定位；同时将其与pRS424载体连接后电转到粟酒裂殖酵母中进行异源表达确定其功能；通过同源重组敲除gt1基因并在不同培养基中培养测定aox1基因表达量。【结果】生物信息学显示与酿酒酵母中已经证明的甘油转运体(sugar transporter 1,stl1)类似，GT1蛋白同样为具有疏水结构域的跨膜蛋白，同时亚细胞定位结果显示GT1蛋白定位于细胞膜上，包含有gt1基因的粟酒裂殖酵母可以在以甘油作为唯一碳源的培养基中生长而野生型不可以；在Δgt1突变体中aox1基因可以获得组成型表达。【结论】分离并确认了巴斯德毕赤酵母中的甘油转运体GT1，并初步证明其与aox1基因甘油阻遏相关。
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