分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2018-11-24 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 将B. circulans 251 β-CGTase应用于海藻糖制备，海藻糖转化率从50.4%提高至71.9 %。为进一步提高底物的转化率，运用易错PCR-高通量筛选技术筛选对以麦芽糖为歧化反应受体的亲和性提高的B. circulans 251 β-CGTase突变体。利用低底物浓度的96孔板4,6-亚乙基-对硝基苯-α-D-麦芽七糖苷（EPS）显色法，最终筛选得到了一株对麦芽糖亲和性提高的突变体M234I。将野生型β-CGTase和突变体酶M234I进行蛋白纯化，测定其酶学性质，结果表明：突变体的比活为345.25 U/mg，野生型则为357.63 U/mg；突变体M234I对麦芽糖的Km为0.2582 mM，仅为野生型（0.4749 mM）的54.4%，对麦芽糖的亲和性显著提高；突变体的最适温度，最适pH较野生型未发生较大变化。以麦芽糊精(DE值16)为底物，将突变体M234I用于多酶复配体系生产海藻糖，酶反应结果表明海藻糖的转化率最高达74.9 %，较野生型β-CGTase提高约3%。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2018-11-08 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 在采用前期已构建的重组菌E.coli BL21(DE3)/pET20b(+)-hic进行高密度发酵制备角质酶时发现，在高诱导强度发酵时，菌体浓度下降明显。同时，通过测定纯化重组角质酶的磷脂水解活性，考察验证了重组酶对宿主细胞的损伤作用。重组酶的磷脂酰乙醇胺活性为9.8 U·mg-1（NPB水解比活力为1047.6 U·mg-1），在卵黄平板出现了明显的反应圈现象。在此基础上，本研究又尝试了高菌体浓度结合高诱导强度的发酵策略，以进一步提高重组酶在3-L罐中的表达水平。优化后的最佳条件及结果为：OD600为75时，恒速流加0.8 g·L ·h-1的乳糖溶液，发酵24 h后，酶活达到最大值4788.0 U·mL-1，约为摇瓶发酵酶活的28倍，与OD600为50时、流加0.2 g·L-1·h-1进行诱导的发酵策略（酶活2233.0 U·mL-1）相比，提高幅度约为114.0%，发酵时间缩短40.0%。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2018-04-11 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 将来源于Clostridium cellulolyticum H10的DPEase基因在食品级表达系统Bacillus subtilis中进行产酶研究，在3-L发酵罐中高密度发酵最终酶活可达495 U/mL，得到高表达量的DPEase酶液。通过硅藻土-海藻酸钠（吸附包埋法）对重组细胞进行固定化研究，结果表明，当海藻酸钠浓度2％，细胞包埋量50 g/L，CaCl2浓度2％，硅藻土浓度1％时，固定化细胞酶活回收率可达64％，固定化细胞与游离细胞相比最适pH不变，最适温度提高5℃，热稳定性明显提高，连续反应7个批次后转化率仍然为28％，仍保持81％的残余酶活，具有很高的工业应用价值。
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