分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2017-11-21 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 目的：探究一种小分子量类弹性蛋白标签（elastin-like protein tag，ELP tag）——ELP30-tag在原核表达系统中的蛋白纯化能力。方法：人工合成ELP30-tag基因并将其构建于pET-28a(+)载体，结合2种内含肽（intein1和intein2）基因和增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein，eGFP）基因，构建4个含有不同元件序列的原核表达载体：pET-ELP30、pET-ELP30-eGFP、pET-ELP30-intein1-eGFP和pET-eGFP-intein2-ELP30；将表达载体转化大肠杆菌BL21（DE3），经IPTG诱导重组蛋白表达，并通过可逆相变循环（inverse transition cycling，ITC）纯化重组蛋白ELP30、ELP30-eGFP、ELP30-intein1-eGFP和eGFP-intein2-ELP30，随后通过调节溶液pH值或添加二硫苏糖醇（DL-Dithiothreitol，DTT）分别诱导intein1和intein2断裂，最后再经ITC分离获得纯eGFP。结果：利用设计的ELP30-tag成功纯化获得了重组蛋白ELP30、ELP30-eGFP和eGFP-intein2-ELP30；重组蛋白ELP30-intein1-eGFP和eGFP-intein2-ELP30中的内含肽可经诱导发生断裂而释放eGFP，但未能分离获得纯eGFP。本研究为小分子量ELP-tag的运用和优化设计奠定了一定基础。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2017-11-21 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 目的：探究一种小分子量类弹性蛋白标签（elastin-like protein tag，ELP tag）——ELP30-tag在原核表达系统中的蛋白纯化能力。方法：人工合成ELP30-tag基因并将其构建于pET-28a(+)载体，结合2种内含肽（intein1和intein2）基因和增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein，eGFP）基因，构建4个含有不同元件序列的原核表达载体：pET-ELP30、pET-ELP30-eGFP、pET-ELP30-intein1-eGFP和pET-eGFP-intein2-ELP30；将表达载体转化大肠杆菌BL21（DE3），经IPTG诱导重组蛋白表达，并通过可逆相变循环（inverse transition cycling，ITC）纯化重组蛋白ELP30、ELP30-eGFP、ELP30-intein1-eGFP和eGFP-intein2-ELP30，随后通过调节溶液pH值或添加二硫苏糖醇（DL-Dithiothreitol，DTT）分别诱导intein1和intein2断裂，最后再经ITC分离获得纯eGFP。结果：利用设计的ELP30-tag成功纯化获得了重组蛋白ELP30、ELP30-eGFP和eGFP-intein2-ELP30；重组蛋白ELP30-intein1-eGFP和eGFP-intein2-ELP30中的内含肽可经诱导发生断裂而释放eGFP，但未能分离获得纯eGFP。本研究为小分子量ELP-tag的运用和优化设计奠定了一定基础。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2017-07-24 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 摘要 目的：克隆获得家蚕（Bombyx mori）Bmtol基因序列，并对其蛋白结构进行预测，分析其在组织和JHA处理后头部的表达差异，为该基因的功能研究提供参考。方法：以家蚕的全组织cDNA为模板利用RT-PCR技术扩增和克隆获得Bmtol基因cDNA全长序列，并提交至GenBank数据库；利用多种生物信息学软件预测分析其编码蛋白的理化特性和结构特征；采用MREGA5.0软件中的邻接法（neighbor-joining，NJ）构建BmTOL及其它昆虫同源TO的进化树；通过qPCR技术分析Bmtol基因在5龄3天家蚕不同组织的表达情况，及JHA处理5龄蚕后在0 h、24 h、48 h、72 h和96 h家蚕头部的表达情况。结果：克隆获得了家蚕Bmtol基因的cDNA序列（GenBank审查中），Bmtol基因的开放阅读框（ORF）长度为759 bp，编码252个氨基酸，预测其蛋白分子量为27.72 KD，理论等电点为6.16，有信号肽，无跨膜结构，且第25—251位氨基酸之间存在一个保幼激素结合蛋白家族JHBP保守结构域；N端为疏水区域，可能与保幼激素结合蛋白的核心部位有关。亚细胞定位分析表明，BmTOL属于分泌型蛋白，主要集中在内质网-高尔基体-质膜分泌途径上。BmTOL蛋白具有3个α螺旋，第34位的Cys和第44位Cys形成一个二硫键链接在α1螺旋和N末端，构成BmTOL蛋白与配体结合的核心部位。序列比对结果显示，家蚕BmTOL序列与其他昆虫TO的氨基酸序列一致性差别较大。家蚕BmTOL与果蝇DmTO的相似性为25.10%，与烟草烟草天蛾的相似性为19.69%，与冈比亚按蚊的相似性为25.78%，与埃及伊蚊的相似性为23.53%，与黑花蝇的相似性为28.17%，与意大利蜜蜂的相似性为23.05%，与苹浅褐卷蛾的相似性为21.18%。系统进化树分析表明，所有选用昆虫TO形成两个大的分支：苹浅褐卷蛾EpTO1、烟草天蛾MsTO、意大利蜜蜂AmTOL、果蝇DmTO和黑花蝇PrTOL聚为一个分支，埃及伊蚊AaTO、冈比亚按蚊AgTOL-2和家蚕BmTOL聚为另一大分支。qPCR结果显示，Bmtol基因在家蚕头部、表皮和精巢有较高表达，其他组织表达量很低或没有。在JHA处理的5龄家蚕的头部，Bmtol基因在处理后0 h、24 h、48 h、72 h和96 h的表达量差异不明显。结论：BmTOL蛋白属于JHBP家族，具有JHBP家族的典型结构；组织表达谱和JHA处理结果暗示，BmTOL属保幼激素结合蛋白（JHBP），在家蚕中除保幼激素结合之外还参与其他多种生理功能。
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