分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2018-12-06 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 目的：白细胞介素(IL)-33具有重要的免疫调控作用，在疾病中扮演着重要的角色。本文旨在通过基因优化实现IL-33在哺乳动物细胞中的高效表达，为疾病机理研究以及疫苗免疫佐剂应用等提供基础。方法：根据小鼠白细胞介素-33成熟肽(mIL-33)的氨基酸序列，以哺乳动物细胞基因表达密码子偏好性进行基因优化设计;化学合成优化的mIL-33基因片段，通过搭桥PCR将编码人CD8α信号肽的核酸序列分别与优化或未优化的mIL-33基因连接,并与绿色荧光蛋白（EGFP）基因分别构建到双表达单元质粒 pBudCE4.1的不同启动子下;重组质粒经 lipofectamine 3000 和PEI转染293FT 细胞;以 Western blot和ELISA检测重组蛋白的表达;收集表达的mIL-33刺激巨噬细胞Raw264.7，ELISA检测培养上清的TNFα水平，以证明IL-33的生物学活性。结果:重组质粒经酶切鉴定及测序分析证实构建成功; lipofectamine 3000转染效率较PEI转染更高；Western blot和ELISA 结果显示密码子优化的mIL-33表达水平较未优化序列更高，在EF-1α启动子和CMV启动子指导下mIL-33在293FT 细胞表达水平相当，CD8α信号肽成功引导mIL-33的分泌，产物具生物学活性。结论: 密码子优化操作显著改善了 mIL-33在哺乳动物细胞中的表达水平，为进一步研究奠定了基础。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2018-03-22 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 目的：构建呈现人白细胞介素-13（ interleukin-13，IL-13）抗原肽的Qβ噬菌体病毒样颗粒（virus-like particles, VLPs）疫苗。方法：将人 IL-13 抗原肽经基因重组插入Qβ噬菌体衣壳蛋白(CP)基因的C末端。在BL21细菌中，经IPTG诱导CP及C端接有IL-13 抗原肽的CP（CP /IL-13）同时表达。以硫酸铵沉淀及蔗糖密度梯度离心进行VLPs纯化及分析嵌合VLPs的存在，以HPLC分析VLPs纯度，以及以电镜观察颗粒形态。小鼠经皮下免疫VLPs后采集血清，以ELISA检测人 IL-13特异性IgG抗体水平。结果：重组蛋白CP与CP /IL-13获得成功表达，两者在密度梯度离心中有一致的、与QβVLPs相同的沉降行为，而CP /IL-13单独无Qβ颗粒行为。经纯化获得了高纯度颗粒，嵌合颗粒与Qβ颗粒形态相似。此外，该VLPs疫苗诱导小鼠产生了IL-13特异的抗体应答。结论：利用共表达策略可成功构建呈现人 IL-13 抗原表位的嵌合VLPs，为以主动免疫方式调控IL-13在疾病中的病理作用，提供了具有临床应用潜能的疫苗形式。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2017-07-24 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 目的: 优化人乳头瘤病毒16型主要衣壳蛋白L1（human papillomavirus type 16 major capsid protein L1，HPV16L1）在毕赤酵母中的表达，并考察可能的影响因素。方法: 四个不同序列特征的HPV16L1基因M16、Y16、P16、W16（其中，M16和Y16按酵母密码子优化，P16为哺乳动物细胞密码子优化，而W16为野生型序列）分别克隆于毕赤酵母表达质粒pPinkTM-HC（高基因拷贝菌落筛选）和pPinkTM-LC（低基因拷贝菌落筛选），并转化不同蛋白酶缺陷的宿主菌。甲醇诱导24小时后，取菌体样品经Western Blot分析L1蛋白的表达。结果: M16显示了最高的表达水平，其次是Y16与P16，而W16几乎无表达。基因序列密码子应用特征分析显示，四个基因的密码子适应指数从高到低依次为Y16、M16、W16和P16。通过自由能和GC含量分析四个序列的mRNA二级结构，Y16为–409.40 kcal/mol和43.85%；M16为–451.50 kcal/mol和47.83%；P 16为–606.50 kcal/mol and 64.10%；W16为–384.70 kcal/mol and 38.01% 。蛋白酶缺陷菌株L1表达高于野生型菌株，质粒pPinkTM-HC与pPinkTM-LC介导的表达无明显区别。结论: 密码子优化操作显著改善了HPV16L1在毕赤酵母中的表达，但表达水平与密码子利用优劣并不完全对应，提示密码子优化仅是部分原因，而mRNA结构与稳定性变化值得探讨。蛋白酶缺陷菌株提高了HPV16L1蛋白的稳定性，显著影响了表达水平。在本研究中，基因剂量对HPV16L1的表达未产生明显影响。关键词 毕赤酵母；表达；人乳头瘤病毒；主要衣壳蛋白L1
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