分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2017-11-26 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 目的：探讨shPLCε对膀胱癌T24细胞瓦伯格效应的影响及其相关机制。方法：（1）慢病毒感染T24细胞，葡萄糖测定试剂盒和乳酸测试盒分别检测细胞葡萄糖利用和乳酸生成情况；q-PCR、Western blot分别检测PLCε、CDC25A及瓦伯格效应相关分子的表达。（2）转染shCDC25A质粒，q-PCR、Western blot检测CDC25A的表达；Western blot检测瓦伯格效应相关分子的表达情况。结果：（1）慢病毒干扰PLCε后，T24细胞利用葡萄糖和生成乳酸的能力降低，同时下调CDC25A、PKM2、GLUT1、LDHA的表达。（2）干扰CDC25A的表达后可抑制PKM2、GLUT1、LDHA的表达。结论：shPLCε通过下调关键分子CDC25A的表达抑制膀胱癌T24细胞的瓦伯格效应，从而为膀胱癌的治疗提供了新思路。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2017-11-26 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 目的：探讨shPLCε对膀胱癌T24细胞瓦伯格效应的影响及其相关机制。方法：（1）慢病毒感染T24细胞，葡萄糖测定试剂盒和乳酸测试盒分别检测细胞葡萄糖利用和乳酸生成情况；q-PCR、Western blot分别检测PLCε、CDC25A及瓦伯格效应相关分子的表达。（2）转染shCDC25A质粒，q-PCR、Western blot检测CDC25A的表达；Western blot检测瓦伯格效应相关分子的表达情况。结果：（1）慢病毒干扰PLCε后，T24细胞利用葡萄糖和生成乳酸的能力降低，同时下调CDC25A、PKM2、GLUT1、LDHA的表达。（2）干扰CDC25A的表达后可抑制PKM2、GLUT1、LDHA的表达。结论：shPLCε通过下调关键分子CDC25A的表达抑制膀胱癌T24细胞的瓦伯格效应，从而为膀胱癌的治疗提供了新思路。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2017-11-13 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 目的：克隆一种季也蒙毕赤酵母菌的尿酸酶蛋白编码基因，并通过重组表达和表征进行确认。方法：测定酵母细胞株C.G.M.C.C 2.1008的rRNA序列鉴定其所属种，串联质谱分析此天然尿酸酶肽段序列搜索同源蛋白，测定转录组验证其诱导表达属性，据季也蒙毕赤酵母ATCC 6260基因组信息推断所得尿酸酶(Uniprot id: A5DFP1)的编码序列设计引物，从C.G.M.C.C 2.1008细胞株cDNA中PCR扩增尿酸酶基因，测序后再克隆至定向表达载体pDE1及pDE2中构建带6His标签的重组表达质粒pDE1-MGU和pDE2-MGU，同时构建无6His标签的表达质粒R-MGU。在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达此真菌尿酸酶，SDS-PAGE和MALDI-TOF-MS测定肽段分子量，以尿酸为底物测定其动力学参数及抑制剂敏感性等性质，并与天然尿酸酶进行比较。结果：rRNA序列表明此菌株为季也蒙毕赤酵母，串联质谱分析胰蛋白酶解肽段表明此天然真菌尿酸酶与尿酸酶A5DFP1高度相似，转录组测序支持此尿酸酶基因高效诱导表达。用所设计引物经PCR从cDNA快速获得编码序列，T载体测序显示其与A5DFP1编码序列仅在第435位碱基不同但氨基酸仍相同。SDS-PAGE发现重组R-MGU肽段约35kDa；MALDI-TOF-MS发现其肽段约17.43kDa且与天然酶一致，但按氨基酸序列计算分子量仅33.98 kDa，表明其可能存在化学修饰。重组表达带6His标签尿酸酶纯化后比活性接近6.0 U/mg；R-MGU米氏常数、代表抑制剂的抑制常数及分子量与天然尿酸酶无差别，但R-MGU很难纯化，使其相同条件下的热稳定性比纯化天然酶略差。结论：成功克隆了一种季也蒙毕赤酵母菌的尿酸酶，并实现其活性形式的重组表达。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2017-07-24 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 、摘要 目的：分析和确认转录因子DLX1在骨形态发生蛋白9（Bone Morphogenetic Protein 9, BMP9）诱导的间充质干细胞C3H10T1/2成骨分化中的作用。方法： 首先，BMP9腺病毒感染C3H10T1/2细胞，RT-PCR和Western Blot检测下DLX1表达变化；随后，利用重组腺病毒技术分别过表达DLX1和RNA干扰（RNA Intenference, RNAi）抑制DLX1的表达，并利用碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase, ALP)染色、钙盐沉积实验（茜素红染色），免疫细胞化学检测骨钙素（Osteocalcin, OCN）表达和裸鼠皮下异位成骨实验分析DLX1对于BMP9诱导的C3H10T1/2细胞成骨分化的影响。荧光素酶报告基因实验和Western Blot分析DLX1对于BMP9诱导的C3H10T1/2细胞Smad1/5/8信号途径的影响。结果：BMP9可以促进C3H10T1/2细胞中DLX1基因和蛋白表达水平；过表达DLX1在体外可进一步促进BMP9诱导的C3H10T1/2细胞的ALP活性、钙盐沉积以及OCN的表达，过表达DLX1亦可促进BMP9诱导的裸鼠皮下异位成骨；反之，RNAi抑制DLX1表达后，由BMP9诱导的C3H10T1/2细胞的ALP活性、钙盐沉积、OCN表达和裸鼠皮下异位成骨均相应均受到抑制。过表达DLX1可进一步增强BMP9诱导的C3H10T1/2细胞中Smad/1/5/8的转录调控活性，RNAi降低DLX1表达则可抑制BMP9诱导Smad/1/5/8的转录调控活性。但是，无论过表达DLX1和RNAi降低DLX1表达均不会对BMP9诱导的Smad/1/5/8磷酸化造成影响。结论：DLX1可以调节BMP9诱导的间充质干细胞C3H10T1/2细胞成骨分化，其调节作用可能是通过影响Smad1/5/8信号的转录调控活性而实现的。
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