分类： 生物学 >> 动物学 提交时间： 2018-12-24 合作期刊: 《动物营养学报》
摘要： 本试验采用反转录PCR(RT-PCR)和cDNA末端快速扩增（RACE）技术克隆获得草鱼乙酰辅酶A羧化酶β（ACC2）基因全长cDNA，并采用实时荧光定量PCR技术研究ACC2基因在肝胰脏、脾脏、大脑、前肠、中肠、后肠、肾脏、肌肉、心脏和肠系膜脂肪等组织中的表达，同时，还对饲喂不同脂肪源饲料12周后草鱼肝胰脏和肌肉中以及饥饿再次投喂后3、6、12和24 h肝胰脏中ACC2 mRNA的表达变化进行了研究。结果显示：草鱼ACC2基因cDNA全长7 533 bp，含1个7 149 bp的开放阅读框，编码2 382个氨基酸，ACC2蛋白计算分子质量为268.34 ku，等电点为6.13。草鱼ACC2基因存在可变剪接，形成另外1个同工型（isoforms），比分子质量为268.34 ku的ACC2蛋白少8个氨基酸。ACC2基因在所有检测组织中均有表达，ACC2 mRNA的相对表达量在肌肉中最高，为29.13，在肝胰脏中最低，仅为1.90。肌肉中ACC2 mRNA的相对表达量与大脑、前肠和心脏差异不显著（P>0.05），但显著高于其他组织（P0.05）；饥饿再投喂后草鱼肝胰脏中ACC2 mRNA相对表达量在12 h达到高峰值，为6.17，之后明显下降，24 h时仅为2.84。本试验成功克隆了草鱼ACC2基因全长cDNA，其主要的功能位点ATP结合位点、生物素结合位点与其他脊椎动物相比基本保守。草鱼ACC2基因主要在肌肉等脂肪分解活跃的组织中表达，投喂不同脂肪源饲料对草鱼肝胰脏中ACC2 mRNA的相对表达量无显著影响；饥饿再投喂后，肝胰脏中ACC2 mRNA的相对表达量在投喂12 h后最高。
分类： 生物学 >> 动物学 提交时间： 2018-12-24 合作期刊: 《动物营养学报》
摘要： 本试验采用反转录PCR(RT-PCR)和cDNA末端快速扩增（RACE）技术克隆获得草鱼乙酰辅酶A羧化酶β（ACC2）基因全长cDNA，并采用实时荧光定量PCR技术研究ACC2基因在肝胰脏、脾脏、大脑、前肠、中肠、后肠、肾脏、肌肉、心脏和肠系膜脂肪等组织中的表达，同时，还对饲喂不同脂肪源饲料12周后草鱼肝胰脏和肌肉中以及饥饿再次投喂后3、6、12和24 h肝胰脏中ACC2 mRNA的表达变化进行了研究。结果显示：草鱼ACC2基因cDNA全长7 533 bp，含1个7 149 bp的开放阅读框，编码2 382个氨基酸，ACC2蛋白计算分子质量为268.34 ku，等电点为6.13。草鱼ACC2基因存在可变剪接，形成另外1个同工型（isoforms），比分子质量为268.34 ku的ACC2蛋白少8个氨基酸。ACC2基因在所有检测组织中均有表达，ACC2 mRNA的相对表达量在肌肉中最高，为29.13，在肝胰脏中最低，仅为1.90。肌肉中ACC2 mRNA的相对表达量与大脑、前肠和心脏差异不显著（P>0.05），但显著高于其他组织（P0.05）；饥饿再投喂后草鱼肝胰脏中ACC2 mRNA相对表达量在12 h达到高峰值，为6.17，之后明显下降，24 h时仅为2.84。本试验成功克隆了草鱼ACC2基因全长cDNA，其主要的功能位点ATP结合位点、生物素结合位点与其他脊椎动物相比基本保守。草鱼ACC2基因主要在肌肉等脂肪分解活跃的组织中表达，投喂不同脂肪源饲料对草鱼肝胰脏中ACC2 mRNA的相对表达量无显著影响；饥饿再投喂后，肝胰脏中ACC2 mRNA的相对表达量在投喂12 h后最高。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2017-12-22 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 酸脱氢酶具有重要的意义。为了获得理想的R-扁桃酸脱氢酶，本研究采用基因组挖矿技术从Lactobacillus harbinensis菌株中获得了一个新型的R-扁桃酸脱氢酶LhDMDH，重组LhDMDH的比酶活高达1264.3 U/mg，约为探针的4倍，在已报道的R-扁桃酸脱氢酶中处于领先水平。同时，考察了4个重组酶主要的酶学特性，它们的最适反应温度在25~30℃，最适反应pH在9.0~9.5。动力学参数的结果表明，LhDMDH对底物的Kcat值为30.28 S-1，明显高于其它重组酶。此外，底物谱分析的结果也表明LhDMDH在外消旋扁桃酸的手性拆分及苯乙酮酸的生物合成中更具优势。本研究在R-扁桃酸脱氢酶基因挖掘方面取得了较为理想的结果，为进一步的改造及应用奠定了坚实的基础，也为其它酶的挖掘提供了可资借鉴的经验。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2017-11-21 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 低温CPC乙酰化酶在7-ACA的生物合成中具有重要作用和显著的优势，开发低温CPC乙酰化酶具有重大的经济价值。为了获得在低温下具有更高催化活性的CPC乙酰化酶，本文在前期的研究基础上，以先前获得的CA IIIM为亲本，借助分子对接的手段确定了它的底物结合区域，并利用pyMOL软件找出了底物结合区域Loop上关键的脯氨酸残基，分析后将选定的脯氨酸用甘氨酸进行替换。借助pET32a质粒在E. coli BL21(DE3)中进行了可溶性表达研究，除P272G外，其它突变体均实现了可溶性表达。P238G、P582G和P679G在13℃对CPC的催化活性分别为1.25、1.04和1.38 U/mg，较亲本的0.85 U/mg有了显著的提高。此外，分别考察了亲本及突变体的温度稳定性，它们之间无明显的差异。然后，在13℃下进行了7-ACA低温生物合成的研究，结果表明反应24 h后CPC的转化率也能达到80%以上。本研究在CPC乙酰化酶冷适应性改造方面取得了较为理想的结果，为进一步的改造及应用奠定了坚实的基础，也为其它低温酶的创制提供了可资借鉴的经验。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2017-11-21 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 低温CPC乙酰化酶在7-ACA的生物合成中具有重要作用和显著的优势，开发低温CPC乙酰化酶具有重大的经济价值。为了获得在低温下具有更高催化活性的CPC乙酰化酶，本文在前期的研究基础上，以先前获得的CA IIIM为亲本，借助分子对接的手段确定了它的底物结合区域，并利用pyMOL软件找出了底物结合区域Loop上关键的脯氨酸残基，分析后将选定的脯氨酸用甘氨酸进行替换。借助pET32a质粒在E. coli BL21(DE3)中进行了可溶性表达研究，除P272G外，其它突变体均实现了可溶性表达。P238G、P582G和P679G在13℃对CPC的催化活性分别为1.25、1.04和1.38 U/mg，较亲本的0.85 U/mg有了显著的提高。此外，分别考察了亲本及突变体的温度稳定性，它们之间无明显的差异。然后，在13℃下进行了7-ACA低温生物合成的研究，结果表明反应24 h后CPC的转化率也能达到80%以上。本研究在CPC乙酰化酶冷适应性改造方面取得了较为理想的结果，为进一步的改造及应用奠定了坚实的基础，也为其它低温酶的创制提供了可资借鉴的经验。
分类： 生物学 >> 动物学 提交时间： 2017-10-10 合作期刊: 《动物营养学报》
摘要： 本试验采用RT-PCR（反转录PCR）和cDNA末端快速扩增（RACE）技术从半滑舌鳎肝脏中克隆了乙酰辅酶A羧化酶α（ACC1）基因全长cDNA，并采用实时荧光定量PCR方法对半滑舌鳎ACC1基因在肠道、肝脏、肌肉、卵巢、脾脏、全脑、肾脏、心脏、肠系膜脂肪等组织中的表达进行了研究；此外，还研究了饲料脂肪水平对半滑舌鳎肝脏中ACC1基因表达的影响。结果表明：1)半滑舌鳎ACC1基因cDNA全长7 811 bp，含1个7 074 bp的开放阅读框，编码2 357个氨基酸，ACC1蛋白计算分子质量为266 ku，等电点为6.42。半滑舌鳎ACC1氨基酸序列保守位点包括1个ATP结合位点(Gly316～Gly321)、1个生物素结合位点(Val785-Met786-Lys787-Met788)、1个辅酶A结合位点(Ser1969～Val1995)。此外，半滑舌鳎ACC1基因存在可变剪接，形成另外2个同工型（isoforms），与分子质量为266 ku的ACC1相比，分别少8和15个氨基酸。半滑舌鳎ACC1氨基酸序列与其他脊椎动物的相似度很高，与斑马鱼和小鼠的相似度分别为93%和87%。2）半滑舌鳎所有组织中均检测到ACC1基因的表达，肝脏和全脑中ACC1 mRNA相对表达量显著高于其他组织（P0.05）。综上，本试验克隆出了半滑舌鳎ACC1基因的全长cDNA，并得出半滑舌鳎ACC1蛋白的主要功能位点为ATP结合位点、生物素结合位点、辅酶A结合位点，与其他脊椎动物相比基本保守。半滑舌鳎ACC1基因主要在肝脏和大脑等生脂组织中表达，饲料中添加鱼油显著抑制其肝脏中ACC1基因的表达，且抑制作用与鱼油添加量成正相关。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2017-09-20
摘要： 熊胆粉作为保健食品和药品已经被使用了近千年。熊脱氧胆酸(Ursodeoxycholic acid, UDCA)是熊胆粉(需求量约为45吨/年)的主要活性成分，广泛用于脂肪性肝病、药物性肝炎、病毒性肝炎等胆汁淤积性肝病。7β-羟基甾醇脱氢酶(7β-HSDH, hydroxysteroid dehydrogenase)是双酶偶联法(图1)催化鹅脱氧胆酸(Chenodeoxycholic acid, CDCA)转化合成熊脱氧胆酸的关键瓶颈酶，其活性、稳定性以及辅酶亲和力均显著影响酶促生物转化路线的技术经济性。我们通过基因挖掘手段获得一个新酶7β-HSDHRt。然而, 迄今报道的所有7β-羟基甾醇脱氢酶大多具有活性低、稳定性差以及工作pH与7-HSDH不相容等共同缺陷, 从而导致目标产物UDCA的时空产率十分有限[1]。因此，采用酶工程技术大幅度提高相关酶的催化性能是决定生物技术能否拯救黑熊的关键所在。在此报告中我们提出了一种多目标共进化策略(MODE, multiobjective directed evolution)，用于改造7β-羟基甾醇脱氢酶的催化活性、热稳定性和最适pH值[2]。通过易错PCR、DNA shuffling和定点突变等方法，最终所得突变体V3−1的比活力比野生酶高 5.5倍，而半衰期延长3倍。此外，突变体的最适pH向弱碱性移动(pH 6.5pH 7.5)，从而更接近于前置酶7-HSDH所催化脱氢反应的酸碱度(pH 8.0)。使用上述共进化的突变酶V3−1进行级联转化反应时，UDCA 的时空产率达到 942 g L−1 d−1, 显著高于天然酶的 141 g L−1 d−1。由此可见，酶催化剂的蛋白质工程改造技术在提高酶的催化合成潜能，促进生物催化工艺在绿色化工制药领域的应用，以及在服务生态文明建设、推动环境保护和生态平衡等方面，均将发挥强大的威力。
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