分类： 生物学 >> 微生物学 提交时间： 2018-11-26
摘要： Background: Evaluating the toxicity or effectiveness of two or more toxicants in a specific population often requires specialized statistical software to calculate and compare median lethal doses (LD50s). Tests for equality of LD50s using probit regression with parallel slopes have been implemented in many software packages, while tests for cases of arbitrary slopes are not generally available. Methods: In this study, we established probit-log(dose) regression models and solved them by the maximum likelihood method using Microsoft Excel. The z- and χ2-tests were used to assess significance and goodness of fit to the probit regression models, respectively. We calculated the lethal doses (LDs) of the toxicants at different significance levels and their 95% confidence limits (CLs) based on an accurate estimation of log(LD) variances. We further calculated lethal dose ratios and their 95% CLs for two examples without assuming parallel slopes following the method described by Robertson, et al., 2017. Results: We selected representative toxicology datasets from the literature as case studies. For datasets without natural responses in the control group, the slopes, intercepts, χ2 statistics and LDs calculated using our method were identical to those calculated using Polo-Plus and SPSS software, and the 95% CLs of the lethal dose ratios between toxicants were close to hose calculated using Polo-Plus. For datasets that included natural responses in the control group, our results were also close to those calculated using Polo-Plus and SPSS. Conclusion: This procedure yielded accurate estimates of lethal doses and 95% CLs at different significance levels as well as the lethal dose ratios and 95% CLs between two examples. The procedure could be used to assess differences in the toxicities of two examples without the assumption of parallelism between probit-log(dose) regression lines.
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2018-11-25 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 人核糖核酸酶抑制因子 (human ribonuclease inhibitor, hRI) 是一种能够调节核糖核酸酶活性的酸性包浆蛋白。通过构建含SUMO、IF2、GST、NusA 、MsyB、Trx和 MBP融合标签的重组表达载体，以大肠杆菌BL21（DE3）作为宿主菌进行自诱导（auto-induction，AI）表达，从而使 hRI 的表达量得以提升。利用MagNi磁珠纯化及电泳分析hRI的表达状况，通过RNase/Sepharose亲和层析获得纯度较高的蛋白。纯化后获得的融合蛋白浓度为2960.513 mg/L，与其它公司的hRI活性进行比较，检测其酶活性约为50 U/μL，并使其成功用于RNA的保护，为NusA-hRI的应用提供理论依据。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2018-11-25 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 猪支原体肺炎（Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp）是由猪肺炎支原体引起的一种存在于世界各地的严重危害养猪业的疾病，严重影响饲料报酬，造成巨大的经济损失。准确、敏感、快速的Mhp检测方法有助于了解Mhp在猪群的流行情况，进而采取相应的预防、治疗和综合防控措施。本文对国内外Mhp病原学、分子生物学和免疫学检测方法进行了综述，为科技工作者全面了解Mhp检测方法提供了参考资料。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2018-11-25 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 目的：本文旨在探讨糖酵解酶丙酮酸激酶M2型（PKM2）对人白血病细胞体外增殖和凋亡的影响及潜在机制。方法：将靶向PKM2的慢病毒载体转染人K562细胞株（shPKM2组），同时设立空载体转染组为对照（Vector组）。采用qRT-PCR和Western blot技术分别检测Vector组和shPKM2组PKM2 mRNA和蛋白的表达以及自噬标志物的变化；CCK-8实验检测细胞体外增殖能力；流式细胞术检测细胞周期和凋亡情况；Western blot检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2表达水平。结果：在稳定干扰PKM2后，PKM2的mRNA（t=11.58，P=0.0003）和蛋白水平（t=11.88，P=0.0003）均明显降低。与Vector组比较，shPKM2组细胞体外增殖能力显著降低（F=118.87，P＜0.0001）。同时，干扰PKM2可使K562细胞周期阻滞在G1期，细胞凋亡率显著增加（t=37.23，P＜0.0001）；使促凋亡蛋白Bax表达增加（t=15.36，P=0.0001）、抗凋亡蛋白Bcl-2表达降低（t=9.965，P=0.0006）。此外，干扰PKM2可减弱K562细胞自噬水平，表现为LC3II降低（tLC3II=10.32，PLC3II=0.0005），而p62水平增加（tp62=14.59，Pp62=0.0001）。还发现自噬诱导剂能逆转shPKM2引起的白血病细胞体外增殖能力减弱（F=96.32，P＜0.0001）。结论：以上结果表明干扰PKM2可抑制人白血病K562细胞的体外增殖并促进其凋亡，其机制可能与PKM2介导的自噬活性降低有关，提示PKM2可能作为白血病诊疗的一个潜在靶点。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2018-11-24 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 木聚糖酶和甘露聚糖酶是两种重要的半纤维素酶，也是两种重要的饲用酶制剂，本研究利用毕赤酵母表达系统中的体外串联表达盒构建多拷贝的方法构建了木聚糖酶DSB和甘露聚糖酶ManA共表达重组质粒pPICZαA/DSB-ManA，将该重组质粒电转化至宿主菌毕赤酵母X33中获得共表达两种酶的重组菌X33/ DSB-ManA，实现了两种酶的共分泌表达，经诱导表达后木聚糖酶和甘露聚糖酶的酶活分别为273.6 U/mL和256.8 U/mL，为单独表达重组菌X33/DSB和X33/ManA酶活的30.4%和73.4%。酶学性质的分析显示DSB和ManA的最适反应温度均为75℃，在45℃-75℃范围内具有较好的温度稳定性，酶活可保持最高酶活的60%以上；DSB最适pH为6.5，ManA最适pH为6.0，在pH 3.0、40℃条件下，ManA处理1 h能保持最高酶活的80%以上，DSB处理1 h时能保持最高酶活的50%以上；DSB和ManA对多种金属离子和化学试剂（浓度为1 mM）具有较好的耐受性，均可保留60%以上的酶活力。本研究利用单一菌株成功完成了不同酶的共表达，为复合酶饲料添加剂的生产和应用研究提供了一定的理论依据。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2018-11-24 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 目的：在Bacillus subtilis中表达异源D-海因酶基因（hyd）和D-氨甲酰水解酶基因（adc），构建重组细胞作为催化剂，用于生产D-对羟基苯甘氨酸（D-HPG）。方法：构建hyd表达质粒，考察培养基中二价金属离子对D-海因酶活性的影响。过表达acoR基因，考察AcoR蛋白胞内水平与PacoA-hyd基因拷贝数的关系。筛选表达adc基因的启动子，构建hyd和adc基因共表达质粒，考察双酶活性菌株的催化特性。结果：成功构建了海因酶表达质粒pHPS和pUBS，培养基中添加0.8 mmol/L的MnCl2·4H2O，使168N/pUBS菌株的D-海因酶活性达到956 U/gDCW。整合表达Pcdd-acoR基因，使LSL02/pUBS菌株的D-海因酶活性达到1470 U/gDCW。单拷贝PAE-adc基因的表达水平相对最高。双酶共表达质粒pUBSC被成功构建，菌株LSL02/pUBSC的最适催化温度为40-45℃，催化活性能够持续12 h，当底物起始浓度为20 g/L时，反应12 h生成的D-HPG达到14.32 g/L，转化率达到95%，收率超过80%。结论：构建具有D-海因酶和D-氨甲酰水解酶双酶活性的重组Bacillus subtilis作为全细胞催化剂，用于海因酶法生产D-HPG，具有技术上的可行性和优势。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2018-11-24 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 目的：在大肠杆菌宿主中过量表达丁二酮还原酶（DAR），同时构建辅酶NADH原位再生系统，利用全细胞高效催化丁二酮不对称还原合成(S)-乙偶姻。方法：PCR克隆多粘芽孢杆菌（Paenibacilluspolymyxa）dar基因，连到质粒pETDuet-1，转化至大肠杆菌（Escherichia coli）BL21(DE3)，构建重组菌E.coli BL21(DE3)-DAR；通过HiTrap TALON柱亲和层析纯化表达产物DAR酶蛋白，测定DAR的比酶活和分子动力学参数。在重组菌E.coli BL21(DE3)-DAR中构建辅酶NADH原位再生系统，协同表达枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的葡萄糖脱氢酶（GDH），构建重组菌E.coli BL21(DE3)-DAR/GDH，并以此重组菌为全细胞生物催化剂，优化催化条件，提高(S)-乙偶姻的产量和产率。结果：获得重组工程菌E.coli BL21(DE3)-DAR和E.coli BL21(DE3)-DAR/GDH。DAR以NADH为辅酶还原丁二酮的米氏常数Km、最大催化速率Vmax、催化常数Kcat分别为2.59 mM，1.64 μmol/L∙min∙mg，12.3 /s，还原丁二酮生成(S)-乙偶姻光学的纯度为95.86 %，具有较好的催化效率和立体异构体选择性。构建辅酶NADH原位再生系统后，重组菌E.coli BL21(DE3)-DAR/GDH可高效催化丁二酮合成乙偶姻。在最优催化条件下分批补料，乙偶姻产量达51.26 g/L，转化率81.37 %，生产速率5.13 g/(L∙h)。结论：使用非手性化合物原料丁二酮生产高附加值的手性化合物(S)-乙偶姻，以重组菌为全细胞生物催化剂合成(S)-乙偶姻，不需额外添加昂贵的辅酶，具有较高的生产应用价值。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2018-11-24 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 将B. circulans 251 β-CGTase应用于海藻糖制备，海藻糖转化率从50.4%提高至71.9 %。为进一步提高底物的转化率，运用易错PCR-高通量筛选技术筛选对以麦芽糖为歧化反应受体的亲和性提高的B. circulans 251 β-CGTase突变体。利用低底物浓度的96孔板4,6-亚乙基-对硝基苯-α-D-麦芽七糖苷（EPS）显色法，最终筛选得到了一株对麦芽糖亲和性提高的突变体M234I。将野生型β-CGTase和突变体酶M234I进行蛋白纯化，测定其酶学性质，结果表明：突变体的比活为345.25 U/mg，野生型则为357.63 U/mg；突变体M234I对麦芽糖的Km为0.2582 mM，仅为野生型（0.4749 mM）的54.4%，对麦芽糖的亲和性显著提高；突变体的最适温度，最适pH较野生型未发生较大变化。以麦芽糊精(DE值16)为底物，将突变体M234I用于多酶复配体系生产海藻糖，酶反应结果表明海藻糖的转化率最高达74.9 %，较野生型β-CGTase提高约3%。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2018-11-24 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 目的：证实酒精可诱导AC16心肌细胞凋亡及其与酒精浓度和作用时间的关系，研究不同浓度酒精干预下AC16心肌细胞中miR-186-5p与X连锁凋亡抑制蛋白（XIAP）表达水平以及心肌细胞凋亡水平的改变，探究miR-186-5p以XIAP为靶基因调控酒精诱导的心肌细胞凋亡。方法:流式细胞术检测细胞凋亡水平，Western Blot、实时定量PCR技术分别在蛋白及基因水平检测细胞miR-186-5p与XIAP表达水平的变化，双荧光素酶报告基因靶基因荧光检测miR-186-5p与XIAP的靶际关系。结果:酒精诱导AC16心肌细胞发生凋亡，且与酒精浓度及作用时间呈正相关；酒精摄入上调AC16心肌细胞中miR-186-5p表达,下调XIAP表达；miR-186-5p参与酒精诱导的AC16心肌细胞凋亡过程，XIAP抑制酒精诱导的AC16心肌细胞凋亡；miR-186-5p以XIAP为靶基因调控酒精诱导的心肌细胞凋亡。结论: AC16心肌细胞经过酒精处理后，细胞的凋亡水平升高，并且随着 酒精作用浓度和作用时间的延长，凋亡水平进一步升高；酒精处理后心肌细胞中miR-186-5p表达量上调，XIAP表达量下调，miR-186-5p以XIAP为靶基因，调控酒精处理后心肌细胞的凋亡。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2018-11-17 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 成纤维细胞生长因子14（FGF14）是成纤维细胞生长因子家族中一员，主要在发育中及成熟的神经系统中表达，研究发现，FGF14在退行性神经系统中的脊髓小脑共济失调27型中发挥着重要的作用，FGF14的功能与各种离子通道关系密切，以钠离子通道为主，活性被神经元的兴奋性调节，根据FGF14的特点，本文归纳总结了FGF14目前的研究进展，为FGF14的基础和工程化研究提供理论依据。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2018-11-17 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 合成生物学是生物学、工程学、化学和信息技术等相互交叉融合的一个新兴领域，在医学、药物、农业、材料、环境和能源等领域具有广阔的应用前景，甚至可能创造出自然界中没有的新生物，被视为生物科技领域的颠覆性技术。本研究分析了合成生物学领域主要国家和地区的相关发展战略、资助项目和政策措施，总结了合成生物学领域专利技术的发展历程，揭示了该领域的专利研发主题分布情况，综合对比分析了该领域的主要国家和主要机构的专利产出情况，以期为我国合成生物学领域的科研工作者和管理决策者提供参考数据
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2018-11-17 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： α-酮戊二酸（α-ketoglutaric acid, α-KG）是谷氨酸脱氨基的酮酸产物，作为一种重要的有机酸广泛用于食品、医药、精细化工等领域。为提高L-氨基酸脱氨酶全细胞催化法合成α-KG的效率及产量，首先通过优化全细胞催化剂制备条件及全细胞转化反应条件，包括发酵过程中的温度、pH、诱导剂浓度，诱导剂添加时刻、诱导时间等；全细胞转化过程中的温度、pH、细胞量、转化时间。各个条件优化后以200 g·L-1谷氨酸钠为底物时，产量最终提高了54.9 %，摩尔转化率为39.6 %。其次，通过定点饱和突变对L-氨基酸脱氨酶进行定向进化以提高其催化能力。经过多次突变、筛选，最优突变体E.coli BL21-pET-20b(+)-pm1152催化200 g·L-1谷氨酸钠生成α-KG最高产量为 100.9 g·L-1，摩尔转化率为64.7 %，较最初对照菌株提高了66.3 %。结果表明，条件优化和饱和突变可有效提高重组大肠杆菌全细胞转化合成α-KG的能力。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2018-11-17 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）进行出芽繁殖时，决定未来分裂平面的出芽位点不是随机选取的，而是选择在前一次细胞分裂位置的对侧出芽，即进行双极出芽。目前对解脂耶氏酵母双极出芽的分子调控机制并不清楚。本研究通过观察蛋白定位及过量表达的方法研究了解脂耶氏酵母中囊泡蛋白YlSec15的功能。结果表明：YlSec15在细胞中有明显的极性定位，在细胞的小芽内以及大中芽的芽颈处富集，过量表达YlSec15抑制了菌丝的形成并使得部分细胞的出芽位点选择方式由双极出芽转变为随机出芽，而引起这一变化的原因可能是由于过量的YlSec15在细胞中不能进行正常的极性定位。此外，YlSec15可能是通过YlRas2介导的信号通路参与调控细胞的菌丝形成及双极出芽。这一发现丰富了解脂耶氏酵母中双极出芽的分子调控机制，也证明了极性生长与囊泡运输之间是相互影响的。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2018-11-17 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 细胞自噬是一种进化上高度保守的胞内降解系统，旨在实现维持细胞稳态以应对不同的细胞应激。在生理状态下，细胞自噬水平通常较低；而在氧化应激、营养饥饿和各种病原体刺激下会显著上调。过去的许多研究都表明细胞自噬在多种组织细胞和生理功能调控中有重要意义。早期研究发现了细胞自噬和中性粒细胞死亡之间的联系，这是与炎症密切关联的必要过程。在人类系统和小鼠模型中表明，细胞自噬在中性粒细胞驱动的炎症和防御病原体方面起着至关重要的作用。细胞自噬对于中性粒细胞主要功能的发挥至关重要，包括脱颗粒，活性氧产生和中性粒细胞胞外诱捕网的释放。骨髓中的中性粒细胞生成，自噬在骨髓细胞生成中发挥关键作用，以及促使髓系祖细胞向中性粒细胞分化。总之，本综述集中讨论了细胞自噬对中性粒细胞的作用，从中性粒细胞在骨髓中产生到炎症反应和NETosis细胞死亡。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2018-11-08 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 以恩诺沙星（ENRO）为模板分子，邻苯二胺（OPD）和邻氨基苯酚（OAP）为复合功能单体，在NaAc-HAc缓冲液中，采用电聚合法在玻碳电极表面制备了能够特异识别模板分子及其结构类似物的分子印迹电化学传感器。试验选用含1mol/L氯化钾及1mmol/L铁氰化钾的混合液作为表征溶液，采用循环伏安法和方波伏安法研究了传感器的电化学响应特性，并优化制备和检测条件。结果表明，在最佳条件下，恩诺沙星在2×10-6mol/L～4×10-5mol/L浓度范围内线性关系良好，检出限为7.0×10-7mol/L，该传感器具有良好的稳定性和重现性，对恩诺沙星以及结构类似物具有良好的选择性。采用该传感器对实际样品牛奶、鸡肉、猪肉和鸡蛋中的恩诺沙星进行检测，加标回收率在83.2%～92.7%之间，相对标准偏差（RSD）在1.0%～4.8%之间(n=5)，该传感器选择性强、稳定性好、操作简便、检测快速灵敏、成本低、具有良好的应用前景。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2018-11-08 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 在采用前期已构建的重组菌E.coli BL21(DE3)/pET20b(+)-hic进行高密度发酵制备角质酶时发现，在高诱导强度发酵时，菌体浓度下降明显。同时，通过测定纯化重组角质酶的磷脂水解活性，考察验证了重组酶对宿主细胞的损伤作用。重组酶的磷脂酰乙醇胺活性为9.8 U·mg-1（NPB水解比活力为1047.6 U·mg-1），在卵黄平板出现了明显的反应圈现象。在此基础上，本研究又尝试了高菌体浓度结合高诱导强度的发酵策略，以进一步提高重组酶在3-L罐中的表达水平。优化后的最佳条件及结果为：OD600为75时，恒速流加0.8 g·L ·h-1的乳糖溶液，发酵24 h后，酶活达到最大值4788.0 U·mL-1，约为摇瓶发酵酶活的28倍，与OD600为50时、流加0.2 g·L-1·h-1进行诱导的发酵策略（酶活2233.0 U·mL-1）相比，提高幅度约为114.0%，发酵时间缩短40.0%。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2018-11-08 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 目的：研究干扰素调节宿主限制性因子SAMHD1的表达而抑制HBV复制的分子机制。方法：首先不同剂量的干扰素α、β和γ处理Huh7.0细胞，通过荧光定量PCR和Western blot检测SAMHD1在转录和翻译后的表达水平；进一步通过siRNA干扰内源性的SAMHD1，再评价干扰素α、β对病毒的抑制效应；最后通过免疫荧光检测了干扰素α诱导内源性SAMHD1 的细胞定位及Southern blot检测了SAMHD1细胞定位对病毒复制的影响。结果：在Huh7.0细胞中，SAMHD1的RNA水平和蛋白表达明显受干扰素α和β的诱导升高；干扰SAMHD1后干扰素α和β对HBV复制的抑制作用消失；SAMHD1定位在细胞核内，干扰素α诱导SAMHD1同样定位在细胞核内，缺失核定位信号后SAMHD1丧失了其抑制病毒复制的作用。结论：在Huh7细胞中，干扰素α、β能诱导 SAMHD1表达上调来抑制HBV的复制，SAMDH1的抗病毒作用依赖于其细胞定位。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2018-11-08 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 当前生物制药领域，由于成本压力、市场需求急剧波动以及生物仿制药的竞争日益激烈，现有的生物制造技术受到诸多挑战，生物技术公司越来越倾向于开发灵活、高效的创新型生产制造工艺。灌流培养作为当前哺乳动物细胞培养的重要工艺之一，不仅可以通过不断移出副产物和添加营养物来提供有利于细胞的稳定环境，以解决蛋白质量不稳定或者表达量偏低等问题，还可以通过提高单位体积产率来优化产能利用率并提高生产效率。本文就灌流培养用于哺乳动物细胞培养的研究进展做了系统介绍，并为其进一步开发与应用提供参考。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2018-11-08 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 摘要【目的】对美洲大蠊内生粘质沙雷氏菌几丁质酶ChiA基因进行克隆、可溶性表达及功能验证。【方法】PCR扩增ChiA基因，TA亚克隆，构建重组表达载体ChiA/pET21b，生物信息学分析和低温诱导表达、SDS-PAGE、Western-Blot鉴定，打孔法对几丁质酶活性检测。【结果】PCR成功扩增了ChiA基因序列，该序列与Gen Bank上的S．marcescens ChiA基因序列同源性达99%；该序列编码571个氨基酸，并能够在原核系统中稳定表达。可溶性表达分析显示：通过低温诱导表达，获得可溶性的目的蛋白；活性试验发现:含目的蛋白的表达产物可分解几丁质，且活性强于美洲大蠊内生粘质沙雷氏菌。【结论】从美洲大蠊内生粘质沙雷氏菌基因组中成功克隆了几丁质酶ChiA基因，通过原核表达系统获得了具有较强活性的可溶性几丁质酶ChiA，为其应用奠定了基础。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2018-11-08 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 古紫质4（archaerhodopsin 4, aR4）与细菌视紫质（bacteriorhodopsin, bR）同属于盐杆菌科，同源性59%，均为光驱质子泵。其功能是在光照条件下将质子由胞内泵到胞外形成跨膜质子梯度，该梯度差被膜上另外一种蛋白ATP合成酶用于ATP的合成，从而完成光能向生物能的转化。aR4和bR具有相似的光循环过程，但质子传递时序不同，aR4是先从胞内吸收质子再将质子释放到胞外，而bR恰好相反。甲硫氨酸-145是位于bR视黄醛发色团键合区的一个重要残基，对其光循环有着重要的影响，而在aR4中处在相应位置上的苯丙氨酸-146是其视黄醛键合区与bR唯一不相同的残基。因此通过定点突变，采用紫外可见吸收光谱、动力学光谱、质子泵功能检测、低温透射红外光谱等手段对比分析研究M145F和F146M单点突变对bR和aR4光循环造成的影响，有助于深入理解aR4结构与功能的关系。研究结果表明，M145F突变造成了bR光循环L的丢失和质子泵功能的减弱，而F146M突变并未对aR4的光循环造成显著影响，且突变后aR4质子释放时序没有反转，表明该位置上的残基在两个体系中的作用不尽相同。
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