应用CRISPR/Cas9技术构建YOD1基因敲除小鼠

分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2018-04-19 合作期刊: 《中国生物工程杂志》

戴红苗 付业胜 张令强

摘要： 目的：应用CRISPR/Cas9技术构建去泛素化酶YOD1基因敲除小鼠。方法：针对YOD1基因设计单链向导RNA（sgRNA）识别序列，构建sgRNA质粒，与Cas9质粒体外转录、纯化后注射入受精卵，通过PCR和测序验证得到F0代阳性小鼠。配繁两代后，取同窝对照的野生型（WT）和敲除（KO）小鼠的主要组织器官研磨，使用免疫印迹（WB）技术检测各组织YOD1蛋白的表达，确证YOD1敲除小鼠模型是否成功建立。统计YOD1杂合子（HET）自交存活后代各基因型比例，分析是否有胚胎致死表型。解剖小鼠分析主要组织器官的表型，进一步利用H.E.染色分析KO小鼠是否存在自发的病理改变。通过血糖耐受实验（GTT）分析KO小鼠的血糖调控能力。结果：基因组测序和WB检测结果显示KO小鼠中YOD1被明显敲除，YOD1敲除小鼠模型成功建立。YOD1杂合子自交后代各基因型比例符合孟德尔定律，提示KO小鼠非胚胎致死。YOD1敲除小鼠肝脏显著小于WT小鼠。GTT结果表明敲除YOD1不影响小鼠的血糖稳态。结论：应用CRISPR/Cas9技术成功构建YOD1基因敲除小鼠。KO小鼠正常出生，无任何胚胎发育缺陷。与WT小鼠相比，KO小鼠肝脏显著减小，但无显著的自发病理变化，KO小鼠血糖控制亦无显著差异。

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