分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2019-01-17 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 通过目的基因的随机整合方式，构建得到的CHO表达细胞系，常会因为目的基因插入到染色体内不稳定区域，而在长期传代过程中出现表达不稳定的现象，这主要是由于位点效应所导致。为了解决这个问题，现利用CRISPR/Cas9技术介导的同源重组，将目的基因直接整合于CHO细胞染色体上稳定表达区域，以克服位点效应带来的CHO表达细胞系的长期表达不稳定。现总共利用该技术获得了2株外源基因（人白蛋白基因）定点整合细胞系；western blot结果显示，细胞上清液的产物具有人白蛋白抗原性；细胞在贴壁状态下，两株细胞系在第3、12、23、35、50代，细胞每日表达的HSA质量接近，且均维持在0.5 pg/cell/day；选取一株表达细胞系，经悬浮驯化后，在批次条件培养下，第1、25及50代的悬浮细胞，在摇瓶内的表达浓度均稳定在13-14 mg/L。本研究显示了将外源基因基因定点整合于CHO细胞基因组内的的可行性；且外源基因整合在稳定表达区域后，重组细胞系具有对外源基因长期表达的稳定性。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2018-01-16 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： SUMO蛋白酶（Ulp1）是切割小分子泛素修饰（SUMO）融合蛋白获得天然N端靶蛋白的一种工具酶，具有酶切效率高，特异性好等优点。但现有市售SUMO蛋白酶Ulp1价格昂贵，操作复杂，限制了SUMO融合体系的运用。利用基因工程技术，合成基因ulp1（Leu403-Lys621），并在N端和C端加入多聚组氨酸标签（His6），构建重组表达载体psvT7-ulp1，将重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)和BL21 trxB(DE3)中。经过高通量筛选技术快速确定最优的表达条件为采用BL21(DE3)作为表达宿主，转接后7 h加入IPTG，IPTG的终浓度为0.1 mmol/L，诱导时间为16 h，最终蛋白表达量占菌体总蛋白的34.5%，重组蛋白Ulp1的表达量为190mg/L，通过Ni-NTA一步纯化即可得到纯度95%以上的Ulp1。通过酶切反应，测定酶活为5.19 U/μl，比酶活为5.23×104 U/mg，是先前报道比酶活的1.87倍，通过酶活动力学分析，Ulp1的表观米氏常数 Km=0.359 g/L，Vm=5.10μg/(mL·min)。将SUMO融合表达体系用于单链抗体（Single-Chain Antibody Fragment，scFv）的表达，得到可溶的SUMO-scFv融合蛋白，使用表达的Ulp1进行酶切并纯化，获得纯度高于90%且N端不含多余氨基酸的scFv,操作步骤简单，显著改善了scFv在大肠杆菌中难于高效可溶性表达纯化的现状。
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