分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2018-03-22 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 胆固醇氧化酶专一性地催化胆固醇为胆甾-4-烯-3-酮，广泛地应用于临床以及食品加工行业。本论文将来源于Pimelobacter simplex的胆固醇氧化酶PsCO4，分别转化到大肠杆菌宿主BL21(DE3)、Rosetta(DE3)和C41(DE3)中，在不同温度（15 ℃、25 ℃、37 ℃）及IPTG诱导浓度（0.01 mM、 0.1 mM、0.5 mM）下异源表达PsCO4。结果表明，转入Rosetta(DE3)菌株的PsCO4蛋白，在IPTG浓度为0.1 mM、15 ℃下经18 h诱导表达，PsCO4可溶性表达量最高(0.63 mg/ml)。异源表达的胆固醇氧化酶PsCO4最适温度为30 ℃，最适pH为7.5。通过TLC, GC-MS检测出PsCO4催化胆固醇生成胆甾-4-烯-3-酮。以胆固醇和β-谷甾醇、豆甾醇和孕烯醇酮为底物，测定PsCO4对四种底物的催化反应动力学参数，胆固醇kcat /Km 为0.08 s-1·M-1分别高于β-谷甾醇(0.04 s-1·M-1)、豆甾醇(0.005s-1·M-1)和孕烯醇酮(0.02 s-1·M-1)。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2017-06-01 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 胆固醇氧化酶是胆固醇代谢过程中的关键酶，临床上用胆固醇氧化酶作为检测血清胆固醇含量的应用潜力巨大。将来源于红球菌Rhodococcus ruber的胆固醇氧化酶ChOG，分别转化到大肠杆菌宿主BL21(DE3)和Rosetta(DE3)中，在不同条件下进行诱导表达，结果表明：BL21(DE3)菌株在诱导温度为16 ℃、IPTG浓度为0.1 mmol/L时，ChOG可溶性表达量最高 (0.49 mg/mL)。ChOG的最适反应温度为30℃，最适反应pH为7.5。最适反应条件下，酶活性达到8.033 U/mg。利用TLC、HPLC对ChOG催化产物胆甾-4-烯-3-酮进行了鉴定分析。三维结构及定点突变分析表明Glu406及Arg408、Glu261在进行胆固醇C3羟基的脱氢、质子传递，以及底物异构化发挥重要作用。
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