分类: 生物学 >> 生物工程 提交时间: 2019-03-05 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要: 目的:构建产fusaruside的毕赤酵母菌株,解决天然小分子免疫抑制剂fusaruside的来源问题。方法:从禾谷镰刀菌Fusarium graminearum PH-1中扩增获得合成fusaruside的相关基因—3位去饱和酶(Δ3(E)-SD)和10位去饱和酶(Δ10(E)-SD)基因;并通过2A肽策略构建两种基因的共表达载体,转化到毕赤酵母GS115中进行双酶的诱导表达;对诱导后的毕赤酵母菌体进行甲醇和二氯甲烷的处理后,经高效液相色谱质谱联用仪(HPLC-MS)检测其中产物变化。结果:3位去饱和酶和10位去饱和酶在毕赤酵母中成功共表达,SDS-PAGE显示3位去饱和酶分子量约为48 kDa,10位去饱和酶分子量约为65 kDa;HPLC-MS显示重组酵母可以产生fusaruside。结论:与fusaruside原产菌株镰刀菌相比,该酵母菌的发酵时间更短,产量更高,为fusaruside的进一步开发与应用奠定基础。
分类: 生物学 >> 生物工程 提交时间: 2018-11-24 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要: 木聚糖酶和甘露聚糖酶是两种重要的半纤维素酶,也是两种重要的饲用酶制剂,本研究利用毕赤酵母表达系统中的体外串联表达盒构建多拷贝的方法构建了木聚糖酶DSB和甘露聚糖酶ManA共表达重组质粒pPICZαA/DSB-ManA,将该重组质粒电转化至宿主菌毕赤酵母X33中获得共表达两种酶的重组菌X33/ DSB-ManA,实现了两种酶的共分泌表达,经诱导表达后木聚糖酶和甘露聚糖酶的酶活分别为273.6 U/mL和256.8 U/mL,为单独表达重组菌X33/DSB和X33/ManA酶活的30.4%和73.4%。酶学性质的分析显示DSB和ManA的最适反应温度均为75℃,在45℃-75℃范围内具有较好的温度稳定性,酶活可保持最高酶活的60%以上;DSB最适pH为6.5,ManA最适pH为6.0,在pH 3.0、40℃条件下,ManA处理1 h能保持最高酶活的80%以上,DSB处理1 h时能保持最高酶活的50%以上;DSB和ManA对多种金属离子和化学试剂(浓度为1 mM)具有较好的耐受性,均可保留60%以上的酶活力。本研究利用单一菌株成功完成了不同酶的共表达,为复合酶饲料添加剂的生产和应用研究提供了一定的理论依据。
分类: 生物学 >> 生物工程 提交时间: 2017-07-24 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要: 目的:构建一个IRES序列介导的多基因共表达载体,实现两个目的基因和筛选标记基因共用一个启动子高效表达,提高多基因稳定共表达细胞株的筛选效率。方法:以实验室前期构建的载体pLV-MCS-Puro为骨架,设计并全基因合成双基因克隆表达元件,连接到骨架载体,构建多基因共表达载体pLV-2MCS-Puro,以DsRed2和EGFP荧光蛋白基因验证该载体用于多基因稳定共表达细胞株筛选的效率。结果:成功构建了pLV-2MCS-Puro载体以及DsRed2和EGFP共表达重组质粒pLV-DsRed2-EGFP-Puro。瞬时转染实验证明该载体能介导多基因共表达。抗性筛选获得了MDCK和Hela两种细胞的多基因稳定共表达细胞池。细胞池涂片荧光显微镜观察和计数表明抗性细胞池DsRed2和EGFP双阳率接近100%。基因组和转录水平PCR及蛋白免疫印迹实验表明DsRed2和EGFP稳定整合到抗性细胞基因组并且两种蛋白表达水平较为一致。结论:成功构建了多基因共表达载体pLV-2MCS-Puro,实现了两个目的基因和抗性基因串联共表达,并且具有高效的多基因稳定共表达细胞株筛选效率。该载体在研究蛋白相互作用以及工程细胞构建等方面具有一定的应用前景。