分类: 生物学 >> 生物工程 提交时间: 2017-11-26 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要: 赖氨酰内肽酶是一种重要的工具酶,广泛应用于科学研究及工业化生产。目前市场上的赖氨酰内肽酶大多是从天然微生物中提取获得,其高昂的价格限制了其广泛运用,重组表达能够解决产量的难题。本文首次对赖氨酰内肽酶进行了综述,包括赖氨酰内肽酶的来源、结构、功能性质、及其主要应用,并重点总结了近年来的重组表达进展,同时对今后的研究方向进行了展望。
分类: 生物学 >> 生物工程 提交时间: 2017-11-26 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要: 赖氨酰内肽酶是一种重要的工具酶,广泛应用于科学研究及工业化生产。目前市场上的赖氨酰内肽酶大多是从天然微生物中提取获得,其高昂的价格限制了其广泛运用,重组表达能够解决产量的难题。本文首次对赖氨酰内肽酶进行了综述,包括赖氨酰内肽酶的来源、结构、功能性质、及其主要应用,并重点总结了近年来的重组表达进展,同时对今后的研究方向进行了展望。
分类: 生物学 >> 生物工程 提交时间: 2017-11-21 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要: 根据模仿葡萄球菌(Staphylococcus simulans)的溶葡球菌酶基因序列以及乳酸克鲁维酵母密码子偏好性设计引物扩增溶葡球菌酶基因表达片段,构建溶葡球菌酶(lysostaphin,Lys)基因表达载体(pKLAC1-Lys),转化乳酸克鲁维酵母(K. lactis GG799),实现了Lys基因的分泌表达。对重组菌株(K. lactis GG799/pKLAC1- Lys)进行NTG随机化学诱变,优化表达条件,筛选获得高表达菌株,并通过Ni-NTA亲和层析纯化蛋白并研究其酶学性质。结果表明:通过诱变重组溶葡球菌酶乳酸克鲁维菌株,Lys酶比活性提高了约5.2倍(约8000U/L)。最适接种量为40g/L,诱导过程中每24h添加一次终浓度为20g/L的半乳糖可提高酶比活性,最适表达pH为7.0-7.5,最适反应pH为7.0-8.0,最适反应温度为37℃。实验表明,低于40℃,pH 3-6之间时,重组溶葡球菌酶较稳定。Sr2+对其酶活性有明显的促进作用,Ba2+、Ca2+、Zn2+、Cu2+、Mn2+、Mg2+对其有明显的抑制作用。
分类: 生物学 >> 生物工程 提交时间: 2017-11-21 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要: L-门冬酰胺酶用于治疗急性淋巴细胞白血病与淋巴瘤,但高昂的价格限制了临床上的广泛应用。重组表达解决了成本的难题。L-门冬酰胺酶所具有的低谷氨酰胺酶活性是其副作用的根源,同时细菌来源的L-门冬酰胺酶能导致危及生命的过敏反应,寻找副作用更低的优质L-门冬酰胺酶及其修饰方法,成为研究的重点。本文综述了L-门冬酰胺酶重组表达概况,及具有更优性质的L-门冬酰胺酶开发进展,并阐明其在临床治疗及食品工业领域的巨大应用潜力。
分类: 生物学 >> 生物工程 提交时间: 2017-11-21 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要: 根据模仿葡萄球菌(Staphylococcus simulans)的溶葡球菌酶基因序列以及乳酸克鲁维酵母密码子偏好性设计引物扩增溶葡球菌酶基因表达片段,构建溶葡球菌酶(lysostaphin,Lys)基因表达载体(pKLAC1-Lys),转化乳酸克鲁维酵母(K. lactis GG799),实现了Lys基因的分泌表达。对重组菌株(K. lactis GG799/pKLAC1- Lys)进行NTG随机化学诱变,优化表达条件,筛选获得高表达菌株,并通过Ni-NTA亲和层析纯化蛋白并研究其酶学性质。结果表明:通过诱变重组溶葡球菌酶乳酸克鲁维菌株,Lys酶比活性提高了约5.2倍(约8000U/L)。最适接种量为40g/L,诱导过程中每24h添加一次终浓度为20g/L的半乳糖可提高酶比活性,最适表达pH为7.0-7.5,最适反应pH为7.0-8.0,最适反应温度为37℃。实验表明,低于40℃,pH 3-6之间时,重组溶葡球菌酶较稳定。Sr2+对其酶活性有明显的促进作用,Ba2+、Ca2+、Zn2+、Cu2+、Mn2+、Mg2+对其有明显的抑制作用。
分类: 生物学 >> 生物工程 提交时间: 2017-11-21 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要: L-门冬酰胺酶用于治疗急性淋巴细胞白血病与淋巴瘤,但高昂的价格限制了临床上的广泛应用。重组表达解决了成本的难题。L-门冬酰胺酶所具有的低谷氨酰胺酶活性是其副作用的根源,同时细菌来源的L-门冬酰胺酶能导致危及生命的过敏反应,寻找副作用更低的优质L-门冬酰胺酶及其修饰方法,成为研究的重点。本文综述了L-门冬酰胺酶重组表达概况,及具有更优性质的L-门冬酰胺酶开发进展,并阐明其在临床治疗及食品工业领域的巨大应用潜力。
分类: 生物学 >> 生物工程 提交时间: 2017-11-13 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要: 目的:克隆一种季也蒙毕赤酵母菌的尿酸酶蛋白编码基因,并通过重组表达和表征进行确认。方法:测定酵母细胞株C.G.M.C.C 2.1008的rRNA序列鉴定其所属种,串联质谱分析此天然尿酸酶肽段序列搜索同源蛋白,测定转录组验证其诱导表达属性,据季也蒙毕赤酵母ATCC 6260基因组信息推断所得尿酸酶(Uniprot id: A5DFP1)的编码序列设计引物,从C.G.M.C.C 2.1008细胞株cDNA中PCR扩增尿酸酶基因,测序后再克隆至定向表达载体pDE1及pDE2中构建带6His标签的重组表达质粒pDE1-MGU和pDE2-MGU,同时构建无6His标签的表达质粒R-MGU。在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达此真菌尿酸酶,SDS-PAGE和MALDI-TOF-MS测定肽段分子量,以尿酸为底物测定其动力学参数及抑制剂敏感性等性质,并与天然尿酸酶进行比较。结果:rRNA序列表明此菌株为季也蒙毕赤酵母,串联质谱分析胰蛋白酶解肽段表明此天然真菌尿酸酶与尿酸酶A5DFP1高度相似,转录组测序支持此尿酸酶基因高效诱导表达。用所设计引物经PCR从cDNA快速获得编码序列,T载体测序显示其与A5DFP1编码序列仅在第435位碱基不同但氨基酸仍相同。SDS-PAGE发现重组R-MGU肽段约35kDa;MALDI-TOF-MS发现其肽段约17.43kDa且与天然酶一致,但按氨基酸序列计算分子量仅33.98 kDa,表明其可能存在化学修饰。重组表达带6His标签尿酸酶纯化后比活性接近6.0 U/mg;R-MGU米氏常数、代表抑制剂的抑制常数及分子量与天然尿酸酶无差别,但R-MGU很难纯化,使其相同条件下的热稳定性比纯化天然酶略差。结论:成功克隆了一种季也蒙毕赤酵母菌的尿酸酶,并实现其活性形式的重组表达。
分类: 生物学 >> 生物工程 提交时间: 2017-07-24 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要: L-门冬酰胺酶用于治疗急性淋巴细胞白血病与淋巴瘤,但高昂的价格限制了临床上的广泛应用。重组表达解决了成本的难题。L-门冬酰胺酶所具有的低谷氨酰胺酶活性是其副作用的根源,同时细菌来源的L-门冬酰胺酶能导致危及生命的过敏反应,寻找副作用更低的优质L-门冬酰胺酶及其修饰方法,成为研究的重点。本文综述了L-门冬酰胺酶重组表达概况,及具有更优性质的L-门冬酰胺酶开发进展,并阐明其在临床治疗及食品工业领域的巨大应用潜力。